来源  TMR Publishing Group

作者  Traditional Medicine Research 编辑部  

 

研究亮点

新开发的Eastern blotting能对粗提物中的人参皂苷进行染色，而双 Eastern blotting能提示人参皂苷的类型和糖数与人参皂苷结构的关系。免疫亲和层析敲除法扩大了一步分离人参皂苷的范围，包括了敲除提取物，从而使粗提物中半抗原分子的真正药理活性变得明显。

研究背景

20世纪80年代，许多单克隆抗体（MAbs) 已经在医学领域积累，但除了天然产物中的靶向药物之外，很少有特异性。20世纪90年代，萜类化合物，生物碱，酚类化合物，植物皂苷等天然产物的单克隆抗体的制备有所增加，并作为一种重要的分析技术应用于多种天然产物。针对Gs的单克隆抗体的调查研究显示，2000年至2020年期间已经建立了Gs-Rb1、Rg1 、Re 和三七皂苷R1和Gg-Rg3的单克隆抗体。此外，有研究在膜上建立了一个新的染色系统，继Northern、Southern 和 Western blotting之后，命名为Eastern blotting。这种新开发的方法在人参的定量和定性控制方面发挥了很好的作用。此外，通过亲和柱结合单克隆抗体对抗原的免疫亲和可用于少量G的质量控制。在这种情况下，通过洗涤液洗脱的部分显示了从粗提取物中去除抗原的轮廓，结果被称为敲除提取物，其可用于确认真正的活性成分。以上这些方法也将在这篇综述中进行讨论。

方法论

半抗原-载体蛋白偶联物的合成

通过碘酸盐氧化法制备半抗原-载体蛋白偶联物。例如G-Rb1与牛血清蛋白偶联G-Rb1-BSA。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定半抗原-载体蛋白偶联物中半抗原的数量

1993年引入了MALDI-tof-MS技术用来确定半抗原数量，得到了G-Rb1-BSA偶联物的质谱。分子峰出现在以80，000为中心的雷达峰，这意味着半抗原数量为5至20 。在毛喉素和鸦片生物碱的测定中也发现了相同的证据，从上述证据中，MALDI-tof-MS可以确认免疫的可能性。

单克隆抗体的免疫、杂交和纯化

通过小鼠腹腔注射半抗原-载体蛋白结合物产生免疫。使用聚乙二醇方法分离脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释法克隆杂交瘤。将克隆的杂交瘤的培养基通过亲和柱，最后用含盐的稀乙酸洗脱吸收的IgG。

单克隆抗体对Gs的交叉反应性

交叉反应性是抗体价值最重要的因素。经研究发现，连接在C-3羟基上的双葡萄糖基团对于G-Rb1单克隆抗体的特异性反应是必需的。换句话说，连接在C-3位的葡萄糖部分可以通过高碘酸钠的氧化而打开，产生醛基，从而与载体蛋白结合。同时6位的糖是必需的，且与20位的糖无关。

人体吸收、生物利用度、药代动力学和代谢中的Gs

人参皂苷是一种结构复杂的化合物，具有典型的三萜、达玛烷骨架和糖，导致人参皂苷在体内代谢困难。研究表明三七中的主要成分三七皂苷R1和G-Rg1的磷脂复合物较三七皂苷R1和G-Rg1的生物利用度显著增加。研究发现斑马鱼对三七皂苷、G-Rg1和G-Rb1的主要代谢产物为羟基化Gs和脱糖Gs。近年来，在大鼠体内施用了具有潜在药理活性的G-Rc，并通过液相色谱-质谱系统进行了药代动力学研究。由于良好的分离性和高灵敏度，上述Gs的生物学研究均采用液相色谱-质谱联用技术进行。在G-Rb1的情况下，测量范围为20到400纳克/毫升。G-Rb1在人参粗提物中的特异性和灵敏度达到纳米量级。中药和人参提取物中的G-Rb1浓度可通过抗G-Rb1单克隆抗体进行分析，无需预处理。

 

Gs定量分析的Eastern blotting系统

Eastern blotting的步骤如下。将Gs涂布于薄层色谱板上，并用合适的溶剂进行显色，然后再用H2SO4喷雾并检测。另取一个薄层色谱板用聚偏二氟乙烯膜片覆盖，加热，用NaIO4溶液处理被吸干的聚偏二氟乙烯膜，NaIO4溶液会后裂解Gs及BSA，然后在聚偏二氟乙烯膜上产生Gs-BSA偶联物。例如用抗G-Rb1单克隆抗体和过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG处理缀合物，最后暴露于于4-氯-1-萘酚-H2O2溶液中，如图2所示。

通过蛋白质印迹法对几种人参进行指纹图谱分析，可以将植物代谢物可视化，并通过染色颜色将其分为PPD和PPT两种类型。使用G-Rb1单克隆抗体对几个Gs进行Eastern blotting分析表明，PPD型Gs染色，如G-Rb1，-Rc和-Rd。另一方面，G-Rg1单克隆抗体的染色模式显示仅检测到G-Rg1和-Re。此外，我们成功地检测到双Eastern blotting，可以分别染色两种类型的G。在这种情况下，可以确认红色表示PPT型，粉红表示PPD型Gs ，如图3所示。该系统可用于Gs的代谢研究。与此同时美国国立卫生研究院的分析仪可用于检测染色带，从而可对代谢物进行定性分析。

  

           

Eastern blotting的另一个应用是可以对人参根切片的G-Rb1单克隆抗体染色，在这种情况下，PPD型Gs的分布可以通过Eastern blotting来检测，结果是韧皮部含有更高浓度的PPD型Gs，木质部低得多，表皮几乎没有，如图4所示。人参细胞和组织中Gs的更多详细信息通过显微镜分析进行研究，如图5所示。

      

人参提取物中G-Rb1的免疫亲和层析敲除法的建立

利用人参皂苷单克隆抗体经琼脂糖凝胶活化抗体偶联、封闭、洗杂、平衡后装柱并制备人参皂苷免疫亲和层析柱。将人参粗提物通过免疫亲和柱并用不含Gs的洗涤液完全洗涤时，G-Rb1在含甲醇的洗脱液的洗脱液中表现为单个斑点。如图6所示，洗涤部分包含除G-Rb1外的所有人参提取物成分。

结论

本文主要对Gs具有特异性亲和力的单克隆抗体的应用进行了综述。重复性好、特异性高、定量的分析检测系统，如酶联免疫吸附试验，有助于快速、准确地控制人参的质量。Eastern blotting系统命名为继Northern、Southern 和 Western blotting之后的第四种印迹，是一种更特异和敏感的分析系统，与其他方法相比，该方法不仅可以用于Gs，还可用于具有药理活性天然产物。此外，利用Eastern blotting法对人参进行组织化学研究，使探索人参皂苷在切片中的分布成为可能。由两种单克隆抗体促进的双Eastern blotting系统可以成功分离新的Gs并阐明它们的结构，并进一步定性、定量和判断人参属物种。同时通过免疫亲和分离Gs是小分子天然产物首次通过该方法进行分离。

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引用格式

Sasaki Y, Shimizu K, Watanabe H, Shoyama Y. Application of monoclonal antibody against ginsenoside in ginseng research: a review. Tradit Med Res. 2021;6(3):25. doi:10.12032/TMR20210118215

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