非小细胞肺癌靶向药物设计新策略与新方法 - 曹洋博士 | 钰沐菡 公益公开课

非小细胞肺癌靶向药物设计新策略和新方法

肺癌是我国发病率和死亡率最高的肿瘤，根据一份最新的报告，我国2016年的肺癌发病率发病死亡人数相对排名第二的肿瘤多出整整一倍。如果要治疗肿瘤，肺癌首当其冲。目前我国每年肺癌确诊人数约80万，占全球肺癌确诊总人数的40%；相比我国人口占全球人口20%的比例是非常高的，说明肺癌对中国具有非常特殊的意义。每年因肺癌致死约61万人，这是非常庞大的数据。但目前为止，肺癌的五年生存率小于20%，与其他肿瘤相比是非常不理想的。

这就提出了一个新问题，对于肿瘤特别是肺癌的研究需要持续深入探索它的机制和治疗方法。肿瘤的生物医学分子机制非常多，肺癌特别是非小细胞肺癌里面有相当一部分发生了EGFR激活突变，这是驱动肺癌发生发展的一个重要原因。EGFR是上皮细胞生长因子受体，是在细胞膜表面的跨膜蛋白。在正常细胞中，它接收到细胞外的信号分子后结合到胞外区，蛋白形成二聚体后会激活胞内的酪氨酸肌酶结构域，打开细胞内的信号通路，调整细胞内的DNA扩增、细胞增殖等一系列反应，从而达到细胞不断复制的效果。但是发生了这类激活突变的肿瘤细胞不需要通过外来的信号分子就可以自发地产生酪氨酸激酶活性，给肿瘤细胞一个信号让它快速复制增殖，在这一类肺癌组织中，EGFR突变占有很大比例，其中一些突变就导致了肺癌的发生。

针对此问题，目前已经开发了很多相关药物，即只要阻断EGFR胞内区的酪氨酸激酶结构域，使酪氨酸激酶活性被阻断，细胞就会停止复制并阻断肿瘤细胞增殖。这都是针对于EGFR发生了19位外显子丢失或者21位外显子的亮氨酸到精氨酸858位突变，这些突变的效果导致了激酶活性的打开。目前已经开发出了吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼等一系列靶向药物。一份统计报告显示，2020年中国的EGFR靶向药物酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的市场已经达到两百多亿。TKI药物开发的早期给大家带来了很多希望，在使用的早期的确让大家看到了靶向治疗的效果，病人的状态很快就得到显著改善。但是使用靶向治疗会存在一个很严重的问题；当患者用药一段时间后，一般是几个月到半年的时间，药物就会逐渐失去效果。这是因为肿瘤本身会发生基因突变，逃避已开发药物的激活；比如第一代酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗替尼会发生T790M突变，刚开始使用时是21位的858或19号染色体等一些基因发生突变。但是用药一段时间后肿瘤组织里面聚集了T790M的突变，第一代和第二代的靶向药物就不能结合到酪氨酸激酶结合域，导致药物失效。类比于当前的新冠病毒，在新冠爆发早期开发了相关疫苗，但是随着病毒的演化，这些疫苗逐渐失效。所以接下来整个领域开发了针对T790M的第三代TKI药物——泰瑞沙，它能够对一代、二代耐药的肿瘤产生明显的治疗效果。但在用药之后，又观察到了新的耐药突变——C797S。这对于药物开发而言是非常让人沮丧的，科研人员千辛万苦开发出了药物，但是病人用不了多久后就失效，又需要针对C797S设计新的靶向药物，即第四代酪氨酸激酶抑制剂。但可以预见的是，使用一段时间后它仍然可能失效。因为肿瘤基因组非常不稳定，会产生大量突变，用一段时间会再次耐药，又要开发新的治疗肺癌的靶向药物。

那么有没有希望从别的途径彻底解决EGFR-TKI的耐药问题呢？我们提出一个想法，能否通过调控EGFR蛋白酶体降解途径的方式降解EGFR。这个思路类似于当前非常热门的PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向联合体）思路，即要阻断靶蛋白，可以把靶蛋白和细胞自身的E3泛素连接酶连在一起，通过细胞自身的蛋白酶体通路降解靶点，利用细胞自身的生物化学机制。

图一. 关键科学问题

但是我们的工作并不是开发PROTAC药物。在前期的工作中我们团队的肖志雄教授和牛孟孟博士通过大量的蛋白筛选发现蛋白分子FBXL2（L2）能够降解EGFR，敲掉L2后，EGFR的含量上升；增加细胞内L2蛋白的含量，EGFR会被降解。在生化实验中可以非常明显地观察到FBXL2是EGFR的E3泛素连接酶。

图二. E3泛素连接酶FBXL2（L2）抑制EGFR蛋白表达

基于前期工作，已知 L2能够降解掉EGFR，那么是否有办法上调L2的含量？已有的生物学研究发现FBXL2本身就有一个泛素连接酶——FBXO3。如果阻断FBXO3和L2的相互作用，细胞里的L2含量上升就会帮助降解EGFR，不管EGFR是否发生耐药，都会抑制肿瘤增殖。非常幸运的是FBXO3的一个结构域叫ApaG domain，目前被认为是和L2即E3泛素连接酶结合的结构域，且前期研究估计到了它和L2的结合界面，所以我们的想法是开发一个小分子抑制剂阻断蛋白-蛋白相互作用。

采用的策略是通过基于结构、对接的药物虚拟筛选，建立在前期开发的筛选平台上，与基本的基于结构的虚拟筛选的思路一致，一方面是对于小分子数据库的整理，另一方面是对于靶蛋白的处理。通用思路是通过分子对接的方法发现能够和目标蛋白结合的已知小分子，并通过能量打分、人工筛选的方式挑选一个活性分子。但事实上如果用这个策略或别的软件以及其他方法筛选，猜想是筛不到能够阻断FBXO3和L2结合的分子。因为目标蛋白FBXO3的ApaG domain的晶体结构是自由状态晶体结构，没有和目标蛋白相互作用状态的复合物结构，它的口袋形式和它的结合分子形式是不一样的。在前期分析中大体上能确定FBXO3和L2结合的界面是比较浅的口袋，大概是分成两个部分，左边和右边各一个小口袋，中间有一些凸起的氨基酸。如果直接用晶体结构做分子对接，很难找到一个匹配好的分子，因为口袋中央有一个关键氨基酸——E341谷氨酸，它挡住了小分子结构结合的空腔。在做设计以及筛选时需要通过前期的模拟，一方面是通过分子动力学对结构的优化，另一方面是通过前面做的蛋白结构预测多构象的计算方法I-TASSER。在这个结合模式上做了大量的构象筛选和搜索后得到了比较好的结合模式，不仅能够把口袋的空腔打得更开，而且末端的羧基集团朝向也比较合理，分子也可以和E341形成比较好的氢键连接。

图三. 小分子药物虚拟筛选

通过前期的处理得到了一系列分子，这个工作采用了DrugBank里面的小分子，包括临床用小分子和实验用小分子。DrugBank收录了已知的政府药品监督管理部门和各国已经批准的药物以及已经在临床或实验上使用的分子。筛选找到比较匹配状态的分子并不多，DrugBank数据库也比较小，通过能量打分和筛选后只找到三个目测还不错的分子。在计算过程中用到了前期开发的一些计算工具如疏水能计算和亲和力计算的算法，使疏水能的计算结果更加精确，因为小分子-蛋白或蛋白-蛋白相互作用中疏水作用起到驱动力的作用，所以对它的刻画十分重要。根据一些物理化学研究，疏水作用和分子表面曲率有关，同样的疏水氨基酸在凹陷区域比凸起区域产生的疏水作用、疏水能量更强。所以提出了一个计算方法，通过对分子表面的计算单元进行表面曲率的权重控制，使它并不是一个简单的线性关系，从而更好地估计分子相互作用时疏水能的损失，此法计算蛋白-配体亲和力的准确性得到较好提升。计算过程中筛选分子对接口袋时，需要优化对接口袋的参数估计。众所周知，做分子对接要明确分子对接口袋的中心和范围，范围要根据分子大小进行调整，我们做了一个比较好的优化模型使筛选过程更加顺利。当筛选了一些比较好的分子或有目标结构时，可以通过分子指纹或其他分子相似性的方法富集活性分子，这就提出了一种多指标包括一维、二维分子指纹、三维结构信息整合在一起的分子相似性的度量方法，在基于分子相似性的活性分子筛选中的效果十分显著。

图四. 计算工具和方法

通过以上工作找到了三个活性分子，包括治疗高血压的药物肾上腺激素β1受体阻断剂奈必洛尔、精神病治疗药物氟班色林以及HIV整合酶抑制剂拉替拉韦钾。这三个分子都是根据前面已有文献以及自己分析设想的口袋，因为到目前为止没有一个复合物结构或明确的数据证明小分子一定会结合到此区域。图五中可以看到筛选的分子在结合上，结构互补性和特征互补性比较明显。首先这些分子都是长条形且左右各一团，分别结合在口袋和两块凹陷区，中间部分会和E341谷氨酸形成较好的氢键连接，第一个分子奈必洛尔有比较强的对称性。通过实验鉴定三个分子是否有效，在细胞实验中发现奈必洛尔有明显下调EGFR的效果，所以猜测奈必洛尔可以阻断FBXO3-FBXL2的相互作用，提升细胞内EGFR泛素连接酶L2的含量以此帮助降解EGFR，这个目标达到了。如果分子加进来后阻断了FBXO3对L2的降解，L2没有降解而是进一步降解EGFR，且不同浓度下对于EGFR的降解有明显的梯度效果。另外两个分子在实验上没有观察到效果，所以对奈必洛尔进行进一步研究，通过免疫共沉淀（CoIP）实验证明奈必洛尔确实结合在FBXO3上，帮助解除它和L2的相互作用。在结合模式上对结构进行更细致的模拟，能够明确它们相互作用的关键氨基酸，实验结果表明突变掉关键氨基酸后相互作用效果全部丢失。

图五. 筛选得到的三个分子

对发生第一代、第二代耐药的突变细胞制作了小鼠异种肿瘤移植模型，观察发现不对小鼠进行腹腔注射奈必洛尔，小鼠肺部的肿瘤组织在非常明显的不断增大；使用奈必洛尔后过一段时间观察到小鼠的肝脏、肺部非常干净，肿瘤体积明显减小。对已经发生第三代TKI耐药的肺癌组织进行实验，结果表明单独使用奈必洛尔对发生耐药突变的情况也有抑制效果；联用第三代TKI药物泰瑞沙，效果进一步增加。为进一步确证这个过程是通过L2途径发生，在移植瘤内敲掉L2发现奈必洛尔或奈必洛尔联用泰瑞沙的效果全部丢失。一系列细胞和动物实验都反映了通过L2途径降解EFGR是一个非常有效的方法，抗高血压药奈必洛尔可以起到预想的调控L2从而降低EGFR的效果。

图六. 奈比洛尔可克服奥希替尼耐药性

综上，通过靶向EGFR的蛋白降解实现了非小细胞肺癌的治疗，与目前大部分通过EGFR酪氨酸激酶抑制剂的方案相比完全不同，即便发生了大量的酪氨酸激酶结构域的各种突变，此法仍然有效。这也揭示了一个新途径以及EGFR的E3泛素连接酶L2的重要作用，更重要的是通过计算机辅药设计方法采取了一系列的新策略，能够进一步实现治疗效果。

我们课题组关注更多的是计算机辅助药物设计或分子设计相关的算法研究，也开发的一些算法和软件，包括计算蛋白配体亲和力的计算打分函数CYSCORE、分子自动对接方法CB-DOCK2、老药新用的计算平台DrugRep、基于分子匹配的对接方法FitDock以及分子相似性的计算方法LigMate，这些工具都是可以在我们的网站上（http://www.labshare.cn ; http://cao.labshare.cn）下载使用。同时还有相关的蛋白药物的计算、分析，包括针对抗体CDR识别的计算方法AbRSA以及新近开发的从BCR数据提取有效的抗体的新方法Abalign。在蛋白方面，包括蛋白结构优化的方法CIS-RR、二硫键的设计方法DBdesign、蛋白设计工具Protein Tools。目前在全世界范围内有很多人在使用这些工具，平均每天使用的用户有两百多个，登记的用户包括高校、研究机构、企业等。

下面介绍两个今年发布的工作——FitDock和CB-Dock2。第一个是药物分子的优化设计的新方法FitDock，这工具是什么呢？假设已经知道了一个分子、目标蛋白、目标靶点是结合的且知道结合模式，结合模式可以是已有的蛋白-小分子复合物或通过分子对接等计算方法获得的结合模式。希望在苗头分子基础上通过替换不同基团、改变骨架等方式进行改造，观察新的分子能否更加有效。此思路和自由能微扰有一点近似，是基于既有的分子结构模式，把预测的分子替换一些基团或少量替换一些骨架和原有的结合模式进行匹配，分析新的模式相对原有模式带来的能量差异。针对此法，我们建立了一套匹配算法并得到比较好的效果。在测试里面可以看到，如果有一个目标分子可以作为模板，那么相比目前已有的各种方法，此法的分子对接准确性已经达到整个领域最高水平。

以上是基于模板的分子相似性的对接计算方法，另外一个是分子的盲对接方法CB-Dock2。CB-Dock2是在几年前开发的分子自动化对接工作的基础上进行了升级。分子对接的手续非常麻烦，要做各种准备工作如找口袋、中心、范围、调整分子的各种参数，前期的工作需要把很多计算模型整合到一起，一些自有算法可以把整个过程变成自动化的计算。新升级的方法可以把前面的基于模板的Fitdock整合进去，现阶段通过大量实验方法已经解析了蛋白配体的很多复合物结构，特别是很多热门的药物靶点，这时如果要做分子对接，可以不需要完全自由的状态去对接，而是参考已有的对接模式，把它置换到已有的结合分子上观察结合模型。新升级的方法在计算对接准确率上有明显提升，从之前的69.4%提升到85%，对接分子的构象相对于真实的晶体构象偏差很小。对比整个领域进行分子自由状态的盲对接方法，这个新方法的成功率最高，相比其他方法存在显著差异，这个工具是一个用户友好的在线工具，可以在服务器网站上上传蛋白、分子或者自己绘制一个希望对接的分子或在已知的分子基础上调整分子结构，这对于分子的设计特别是苗头分子的改造是非常方便的，上传苗头分子后通过在线网站上的分子自由绘制工具得到新的分子，点击提交后无需设置其他参数就可以进行分子对接的计算，几分钟后即可得到计算结果。它包含了两种模式，一个模式是基于自由状态的对接，另一个是基于模板的对接，各个模式里预测了各个口袋、对接模型、对接打分、对接参数、对接中的关键氨基酸，这些信息都可以提供，用户通过在线三维结构显示窗口进行观察和分析得到的结果是否可靠或提供的信息是否有用。如果在对接过程中使用了模板分子，也可以在上面观察原始分子和对接分子之间的差别在哪里，从而更好地评估对接结果是否可信。

图七. CB-Dock2的对接准确率及使用

课后提问与回答：

Q1：L2是将所有的EGFR都降解吗？这样会影响正常的生理功能吗？如果不是针对所有的EGFR，那如何识别到突变的EGFR呢？

答：一个关键问题是这个药物是不是对于正常细胞也有伤害。在肺癌细胞里面EGFR是高度表达的，特别是EGFR相关的L2。用药会对正常细胞会有一些影响，但是可以看到在肿瘤组织里面EGFR是高度表达受影响的蛋白；对于调控，在正常组织和肿瘤组织里面存在显著差异。所以对于肿瘤患者而言，为了获得更好的疗效，可以容忍L2降低EFGR。但是在动物实验中，我们用了大量的奈必洛尔也没有看到小鼠的机体变化，无论是体重、身体状态都是正常的。对于野生型和突变型不存在选择性都有效果。目前在现有的分子基础上已经设计了一些新的分子，活性得到很大提升。

Q2：在动物实验中，奥希替尼和奈必洛尔的浓度是如何确定的？蛋白降解用的10微摩尔以及20微摩尔浓度相对比较大，在动物实验中能达到有效的降解浓度吗？

答：是的，由于这个分子本身是老药新用，它本身其实并不是结合FBXO3。奈必洛尔本身是β1受体阻断剂，所以结合在目标结构上的活性不是特别高，我们测试到的IC50大概是9微摩尔左右，并不是特别理想的活性状态。但是在动物实验或细胞实验中的效果非常明显，一个原因是它并不像其他抑制剂一样直接抑制目标分子，对剂量要求非常高。因为L2对于EGFR的降解效果非常明显，只要少量提高L2，EGFR降解就非常显著。所以即便分子本身量不太高，也得到了比较好的效果。在动物实验中，用药量大概是50毫克的剂量，但这是我们团队做实验的老师同学来完成的，这部分我不是特别熟悉。这样的浓度在动物上看不到特别的影响，还可以提高剂量。

Q3：如果降解分子和抑制剂分子联合用药，最后的结果一定是协同作用吗？是否会出现某一个分子的效果覆盖另外一个效果的情况？

答：这个问题非常重要，相互作用是不是真正的产生协同作用，在我们的实验结果里面不能给出完整的答案，但是从数据上看到的效果，假如对于PC-9做了T790M和797位点的突变，泰瑞沙是完全失活的，只使用泰瑞沙的效果和对照组的效果是一样的，但是只用奈必洛尔是有效果的，联合用药后效果进一步增强。从这个角度上讲，我们认为存在协同关系。但是进一步的机制还需要更深入的研究，因为L2通路还有很多其他影响的蛋白。

Q4：L2除了降解EGFR会降解其他的靶点蛋白吗？

答：会。关于L2的相关研究，我们团队的牛孟孟博士最近做了很多工作，其实它有很多相关调控通路。但是在这个工作中，最主要的是EGFR通路，其他调节功能可能会在今后的研究报告中公布给大家。

Q5：曹老师如何看待酪氨酸激酶药物的发展前景？

答：在刚才的报告中提到了酪氨酸激酶会产生耐药，这是靶向药物的一个普遍问题，对于肿瘤这种基因组稳定性很差的对象，药物发生耐药是很自然的情况。其实就是在不断地作斗争，发生耐药后想办法克服。所以从长期角度或者相当长一段时间而言，我觉得TKI有比较大的市场前景。或许在未来较长一段时间甚至更长一段时间内之后，可能发现新的方式实现不依赖TKI就可以达到阻断肿瘤细胞增殖目的的药物，这当然是更好的。但是到目前为止，即便是使用奈必洛尔或进一步衍生的新的分子仍然需要很长时间的研究才能够得到一个比较好的满意效果。所以在可以预见的未来TKI是很重要的，而且可以看到药物和TKI联用是有效果的，所以不管是单独或联用使用对于肺癌的治疗都是非常有效的。

Q6：开发第四代的EGFR抑制剂，为了克服奥希替尼的耐药性，就要求第四代的抑制剂对于野生型的EGFR没有抑制活性，对突变型要有选择性，那阻断L2会不会有潜在的很大的毒副作用？

答：如果L2已经降解了EGFR，那么第四代药物就没有靶点了，就不会有副作用这是理想情况。假如第四代的药物降解了EGFR，我们的药物再加进来，此时L2会通过其他通路起作用，这时可能会有一些副作用。但是L2途径通路对于身体、细胞的生长或者其他功能机制研究目前还不清晰，所以还需要进一步研究才能够得到更准确的回答。但不管第三代或第四代都可能有这样的问题。

Q7：一代、二代EGFR抑制剂50%左右会产生790甲硫氨酸突变，另外的50%其实是无药可用的。这个策略对于另外的50%是否也有效？

答：另外的50%有很多原因，假如这50%里面有一些产生了不依赖EGFR激活，但是下游仍然可以激活这种通路的突变，那我们的药物就没有效果了；假如50%里面存在一些仍然是导致了酪氨酸激酶活性激活，但是并不包含在T790M上，那么药物是有效的。要看这50%里面是不是EGFR驱动的肿瘤，如果不是EGFR驱动的，就没有效果。

Q8：针对您开发的软件，用于药物分子优化的自由能微扰(FEP)和Fitdock比较的话，效率和准确度上的优势如何？

答：Fitdock只是一个快速简易的工具，它是比较粗略化的评估结合模式，评估基团调整之后相互作用带来的影响。自由能微扰(FEP)是做非常大量的动力学模拟、对构象的各种状态进行充分的采样，所以自由能微扰(FEP)比Fitdock要强很多，但是对于高通量或大批量的计算而言，Fitdock能够得到一个先期的结果，可以提供预先的提示，我想这两种方法应该是可以结合使用的。

Q9：您开发的这些对接平台可以用于小分子和核酸药物靶点的对接吗？

答：非常遗憾，我觉得我们的方法对于核酸可能是不太适用的。因为核酸分子本身有比较高的柔性，它是一个含有可旋转键的数量非常多的长链。虽然我们的方法支持小分子柔性的自由旋转，但是柔性相关的可旋转键太多，采样效率会非常低。我觉得针对于蛋白、核酸分子对接应该使用一些专门的工具。算法领域会有相关团队正在往这方面努力，希望能够对于蛋白-配体、蛋白-核酸对接得到更好的效果。从计算上，假如核酸很小很短，就只有几个碱基，我们的工具应该可以进行对接，只是个人评估对于结合以及准确性而言可能是不利的。

Q10：用于老药新用的DrugREP是如何工作的呢？它的算法是什么？

答：DrugREP是整合了基于受体或配体的计算。假如有一个受体结构，那么会自动的在已有的药物库包括Drugbank、中药分子库里面进行对接筛选，帮助判断这个靶点是否有药物-蛋白相互作用。另外一方面结合了前面相似性的计算模型LigMate、FitDock以及一些分子指纹的方法帮助查找基于现有的活性分子在已有的药物里面能不能找到跟它有共有特征的分子，可以给你一些提示这个老药是否可以用在新的场合。这工作正在投稿中，下半年大家可能可以看到。

Q11：对您课题组的研究感兴趣，想问您课题组招收申请考核博士吗？之前没有CADD的基础，从事的是纯深度学习的算法开发工作比如计算机视觉、声学以及少量自然语言处理。

答：欢迎计算机背景的同学报考我们实验室，博士是接受申请的。但是有一些条件，要看具体每年的研究生院提出的一些基本条件能否达到。