QPCR实验常见问题分析

1、为什么在RNA提取时，RNA总量会很低？

首先要看在RNA提取中细胞是否裂解充分。加入Trizol到孔板或者平皿后，要用移液器反复吹打几下。如果不确认是否裂解充分，我们可以把培养板密封好，放置于显微镜下，观察是否还有细胞，正常情况下细胞都脱落、裂解，视野中没有完整的细胞形态。

②，要确保有足够的细胞量，正常情况下12孔板一个孔作为一个样本，如果熟练24孔板的一个孔细胞量是足够做实验的，如果细胞体积大，或者RNA量上不去，就用6孔板来做，或者用平皿。

③，在提取RNA加入的试剂的比例要对，以Trizol为例，1ml的Trizol对应试用的是200微升的氯仿和500微升的异丙醇，如果要减少Trizol的用量就相应的按照比例减少后面试剂的使用量。

④，异丙醇加入后会分层，需要轻摇混匀。RNA溶液中异丙醇的浓度上不去是不会出现RNA沉淀的，所以加入异丙醇后要摇匀溶液。

⑤，RNA出现沉淀后，要用乙醇洗涤沉淀两次，这时沉淀是清晰可见的，我们要用记号笔标记一下沉淀的位置。因为在沉淀晾干后会变得透明，加入DEPC水的时候很可能溶解不到沉淀的位置。

最后，用DEPC水溶解时，最好先加入10微升，溶解后检测一下浓度再稀释，如果RNA太稀就没有办法做后续的实验了。

2、QPCR结果为什么没有差异？

这可能是实验操作出现了问题。

很多人会存在一个误区，认为逆转录时加入体系的RNA总量越多越好。

以汉恒生物cDNA反转录试剂盒为例，在配逆转录体系时，RNA模板的总量应控制在10pg-1μg之间，超出这个范围反而会导致结果异常。

3、如何判断引物设计是否有问题？

如果引物能扩增目的片段，扩增曲线呈现S型，如果呈指数增长型，可能是cDNA浓度过低，可适当增加cDNA浓度。

溶解曲线应该只有一个峰值，而且峰值的位置是在Tm附近，距离Tm较远，或存在多个峰值则需要重新设计引物。

如果怀疑仪器传感器问题，可以将QPCR产物做琼脂电泳。

如果引物能扩增片段，会在80-250bp附近出现一个条带。

4、如何验证提取的RNA是否合格？

一般使用紫外分光光度法，根据OD260和OD280以及OD260和OD230的比值来判断

当OD260/OD280在1.8-2.0之间时，说明RNA的纯度合格，可用于后续试验。

OD260/OD280＜1.8 ，说明可能有蛋白质或者酚类物质的污染。

如在230nm处有吸收峰，说明RNA提取中引入了有机化合物和盐离子的污染，理想状态下OD260/OD230应当在2左右，如有污染比值会小于2。

此外还可以用电泳法检测RNA完整性。