JACS：单个活细胞体系中的Resistive-Pulse传感

       大家好， 今天和大家分享一篇发表于 JACS 上的工作， 题目为“Resistive-PulseSensing Inside Single Living Cells”。本篇文章的通讯作者是美国纽约城市大学皇后学院化学与生物化学系 Michael V. Mirkin 教授和南京大学化学化工学院的江德臣教授。Resistive-Pulse 传感技术主要基于颗粒经过纳米孔或纳米通道产生阻塞电流的原理，常被用于检测纳米尺寸的单个颗粒或单个细胞囊泡。但由于Resistive-Pulse 检测的灵敏度很高，因此很容易受到基质中各种物质的干扰， 现有的 Resistive-Pulse 传感技术对单个颗粒或单个细胞囊泡等的检测都是以成分较为简单的大体积溶液体系为分析对象， 并且需要确保溶液相体系中几乎没有杂质或表面活性剂。将其应用于复杂的细胞环境的直接检测是十分困难的。
       本工作中，作者将 Resistive-Pulse 传感中用到的纳米管同时作为扫描离子电导显微镜（ scanning ion conductance microscopy， SICM）探针， 结合 Resistive-Pulse传感与 SICM 发展了能够在单个细胞内或单个细胞周围检测细胞囊泡或颗粒的Resistive-Pulse 传感技术（图 1）：探究了探针插入细胞膜过程中的离子电流变化；实现了巨噬细胞（ RAW 264.7） 中囊泡（吞噬体、溶酶体、吞噬溶酶体）、细胞内吞的金纳米粒子、胞囊泡中活性氧和氮（ ROS/RNS） 的检测；还实现了乳腺癌细胞（ MDA-MB-231）释放细胞外囊泡过程的观测。

      作者制备了一系列不同材质、 不同尺寸的纳米管，包括普通的石英管，导电碳镀层管（ conductive carbon nanopipettes， CNP），铂镀层 CNP，尺寸为 25 nm 到400 nm。首先利用 150 nm 的石英管探究 SICM 探针插入细胞膜的过程。向溶液相的 Ag/AgCl 电极及管内的 Ag/AgCl 电极间施加 0.4 V 的电压， 使探针逐渐接近固定的 RAW 264.7 细胞，在电流变化上观察到探针靠近细胞、穿破细胞膜、进入细胞三个过程（图 2）。其中，1过程探针与细胞膜距离较远，电流与距离无关；2 过程表示探针作用于细胞膜并刺穿，电流快速下降；3 过程表示探针进入细胞质，此时能够固定探针位置检测 Resistive-Pulse 信号。该电流距离特征曲线在后续的细胞分析中能够用于明确探针在细胞中或细胞周围的定位。

      随后，作者检测了 RAW 264.7 细胞中大量存在的囊泡（吞噬体、溶酶体、吞噬溶酶体）等。利用出口尺寸 140 nm 的石英管，检测到 Resistive-Pulse 信号的位移时间为 3-10 ms 且振幅分布非常广， 1%到100%电流封闭，表面所检测的囊泡尺寸为 40-140 nm。当更换更小尺寸的探针（32 nm）时 未检测到 ResistivePulse 信号，表明吞噬体、溶酶体、吞噬溶酶体等囊泡尺寸均大于 30 nm。常见溶液相体系中的 Resistive-Pulse 信号是不对称峰，电流先快速降低再缓慢恢复，而细胞内测得信号电流下降缓慢且位移时间更长，这与细胞内的高粘度复杂环境有关。作者还检测了 RAW 264.7 细胞内吞的 10 nm 金纳米粒子。由于在之前的实验测试中表面，细胞中不存在 10-30 nm 的颗粒信号，因此，作者向细胞中引入10 nm 的纳米金，并用 30 nm 尺寸的探针检测，用于方法验证，还能用于研究纳米粒子在细胞内的聚集过程。其信号检测及位移时间分析结果均与之前的囊泡测试体系相同。且细胞内纳米金的 Resistive-Pulse 信号出现频率随纳米金与细胞孵育时间增长而提高。
       以 CNP 作为工作电极在实现 Resistive-Pulse 的同时还能够测试碳层表面发生的氧化还原反应。因此，作者还利用 CNP 探针或铂镀层 CNP 进一步检测了囊泡中的活性氧和氮（ROS/RNS）。在 210 nm 铂镀层 CNP 测试中（图 3）， 在由于囊泡阻塞探针而出现的电流降低的 Resistive-Pulse 信号外，还出现了明显的由于囊泡与碳电极表面碰撞，其中 ROS/RNS 氧化而产生的电流上升的信号， 由于探针限制了仅能测试到来源于单一囊泡中的 ROS/RNS 信号。在 CNP 电势为 0.8 V时， 能够检测到四种巨噬细胞内主要的 ROS/RNS（H2O2， ONOO-， NO•和 NO2–）。通过不断提高电势分别实现四种 ROS/RNS 的依次检测：300 mV （H2O2）， 450mV （H2O2， ONOO-）， 620 nm （H2O2， ONOO-， NO•）， 800 mV 四种 ROS/RNS。通过检测到的电流估算单个囊泡中的四种 ROS/RNS 含量约为 pmol 量级：1.1x10-8 (H2O2)， 1x10-9 (ONOO-)， 6.7x10-8 (NO•)， 1.1x10-7 (NO2-)。

      作者还将 300 nm 的石英探针位置固定在细胞外，靠近细胞的位置，用于检测 MDA-MB-231 细胞释放到细胞外的囊泡（图 4）。囊泡在亚微米级别细胞及纳米尺寸下的扩散时间基本处于毫秒级，因此，该技术能够用于囊泡的实时检测。该技术检测获得的细胞释放囊泡频率约为 0.4 s-1，该频率确实远小于细胞内检测到囊泡的频率。

      综上所示， 作者搭建了局域的 Resistive-Pulse 传感平台，成功将其应用于单细胞内及单细胞周围n 尺寸囊泡/纳米颗粒的实时检测，并同时能够获得单一囊泡中 ROS/RNS 含量信息。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.9b13796