Nature methods: 单细胞信号网络
大家好， 今天要跟大家分享最近发表在 Nature methods 上的一篇利用单细胞质谱流式技术进行类器官内信号网络分析的一篇文章，题目为： “Cell-type-specific signaling networks inheterocellular organoids”，通讯作者是来自伦敦大学学院癌症研究所的 Christopher J. Tape.。
《自然-方法》 将单细胞多模态组学评选为 2019 年度技术，在这样的背景下，这篇文章的创新点就在于在单细胞层面对细胞类型、细胞状态， PTM 翻译后修饰等角度进行综合分析，从而对信号网络包括细胞微环境产生新的理解与阐述。
类器官是一类可以自主生长的三维体外组织模型， 由于其生长环境与包含的细胞类型与母体组织十分相似， 并且保留了细胞间的相互作用， 与传统的细胞培养模式相比，类器官可以更准确的反映母体组织的生理特征，也因此被越来越多的生物学家利用进行体外疾病模型的模拟。
蛋白质翻译后修饰（PTM） 信号网络的紊乱与疾病的发生密切相关， 因为不同细胞类型具有不同特征的信号网络结构， 因此类器官也应该具有与其生物学功能密切相关的细胞类型特异的信号网络结构。因为类器官是在体外富含蛋白的胞外基质（ECM） 中生长的， 因此直接研究会对蛋白层面上的研究造成很大干扰， 而通过物理切割的方法来实现与基质的分离，又很难保持细胞的原始状态，并且常规的蛋白质组学研究无法解释类器官细胞类型间的特异性，因此在单细胞层面上对类器官进行原位、细胞特异性以及多通道的 PTMs 研究就变得十分重要。
基于此，作者发展了一种多变量的编码质谱流式技术（multivariate-barcoded MC）来分析单细胞层面的类器官的 PTM 信号网络（如图 1 所示） ，并继而揭示了肿瘤微环境与致癌基因突变对细胞信号网络所产生的影响。首先作者分别利用 127IdU、 PHH3 以及 cyclin B1 来标记小肠类器官细胞的不同周期，再用胰酶以及磷酸酶来处理消化 ECM， 消化结束后使用抑制剂抑制两种酶的活性，再用多聚甲醛（PFA） 进行固定，保持细胞状态， 再加入顺铂来对活细胞以及死细胞进行区分染色，分离成单细胞状态后孵育与细胞类型以及 PTM 相关的抗体， 之后就是经典的质谱流式流程， 从而可以获得 PTM、细胞类型以及细胞状态的多维信息。
获得的多维信息，作者通过 UMAP 的算法对其进行降维可视化处理，从中作者发现，干细胞以及 Paneth cells 大部分具有增殖能力，而分化的上皮细胞则更多处于分裂期后或者凋亡状态。因此该方法可以提供关于大量细胞类型以及状态特异性的众多信息。之后作者又利用相同算法分析了细胞类型、细胞状态与参与各种信号通路的 PTMs 之间的关系（如图 2） ，并且利用 EMD 以及 DREMI 两种计算指标来对 PTM 的相对强度以及其之间的关联程度进行了量化， 作者发现在所有的类器官细胞类型中， WNT 信号通路中的 pGSK-3β [S9]与非磷酸化的 β-Catenin 均被抑制，而在经典的理论中， WNT 信号主要是由蛋白间相互作用驱动，而与 PTM 无关， 除此之外，作者还发现了 MAPK 以及 PI3K 代谢通路具有明显的细胞类型特异性。总之， 通过该研究可以发现细胞类型以及状态与信号网络密切相关。
在此基础上，为了研究健康组织与疾病组织之间的分化信号转导， 同时分析多种类器官，作者进一步发展了原位的巯基反应活性的类器官编码策略（TOBis） （如图 3） ， 这种方法可以不受胞外基质的影响，原位结合基质中的类器官，并且作者设计了 6 种同位素标签，可以在过滤掉 cell doublet 的情况下， 对 20 种不同的样品进行同时分析，从而可以进行样品之间的同批次比较。
在此基础上，作者以直肠癌肿瘤微环境模型为研究对象，研究了致癌基因突变以及共培养的细胞类型对信号通路的影响（如图 4） 。作者通过不同的突变体与共培养细胞（如结肠纤维母细胞与巨噬细胞） 的组合，构建了 19 种类器官分析样本，利用 TOBis 方法以及下游的数据分析， 作者发现致癌基因突变与肿瘤微环境对 PTM 信号网络造成的影响相当，但是对于 PTM 之间的关联性则主要由基因型决定，而非微环境。基质细胞明显上调了突变体中的 PI3K 的信号通路强度， 因此 PI3K 信号通路的过度活化可能是导致 CRC 病人体内的高含量基质肿瘤细胞造成的。
综上，作者对类器官单细胞层面的信号网络进行了多层面的综合分析，这也是未来单细胞组学的发展趋势，即实现多模态整体分析，从而得到更为整体与深入的单细胞信息。其中 TOBis 的方法可以在今后实现多通量样品检测方面加以借鉴。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0737-8
