病理组织固定浅析一

距离上期推文已经1个多月了，最近这一个月实在是太忙了，没时间思考、总结，也就没有输出。实践、思考、优化、再实践才能进步。

最近一部分免疫组化实验结果不太美丽，找了找原因，可能的原因有很多，每一步都有可能导致结果不理想，今天最想聊的还是染色前样本制备工作之一的固定，这些染色前样本处理很重要，怎么强调都不为过。

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基础概念

王伯沄老师在《病理学技术》里是这么说的：将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定”。

病理学组织固定的主要目的是保持组织细胞内外结构清晰，尽量减少细胞成分的丢失。

常用固定方法

物理学方法：干燥、加热、微波、冻干；

化学方法:交联固定、沉淀固定、交联与沉淀联合固定；

常用固定液

甲醛、重铬酸钾、苦味酸、升汞、丙酮、酒精、Bouin液、Carnoy液等

现在最常用的是10%中性缓冲福尔马（NBF)林交联固定。

为什么是NBF?

甲醛分子量小，活性适中;穿透性较好，交联度适中;组织收缩率低;可固定大多数生物大分子物质而且成本低。

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NBF固定

原理

首先甲醛小分子可以快速溶入水中，并与水分子发生化学反应，形成亚甲基水合物H2C=O + H2O- HOCH2OH，其次亚甲基水合物再和蛋白质里的氨基酸发生交联，形成一个有活性的亚甲基侧键；最后随着时间的加长，亚甲基活性基团相互之间发生交联。

影响固定的因素

温度

提高固定温度会加快固定液在组织中的扩散速度，加速固定液和组织成分之间的化学反应。

不着急的可以放室温固定，着急的可以在35-45°之间升温固定。

时间

样本离体后尽快放入福尔马林固定液，最长不超过半小时，固定的时间根据组织大小不同而不同，总体范围在8-72小时之间，太短固定不充分，太久会过度交联。

渗透率

根据彼得·梅达瓦（Peter Brian Medawar，诺贝尔生理学或医学奖获得者）的设计，渗透率可以表示为 d = K√t，其中 d 是渗透深度，K 是扩散系数（固定剂不同，扩散系数不同），t 是时间。这意味着，扩散系数 (K) 是固定剂在一小时内扩散到组织中的距离（以毫米为单位）。

10% 的福尔马林溶液中，K = 0.78。这意味着福尔马林固定剂一个小时内渗透深度不会超过 1 毫米，而渗透到 10 毫米厚标本的中心大约需要 25 小时，即 5 毫米（= 5² 小时）。

而且随着固定时间的增加，渗透率是逐渐下降的，实验室可以在放进福尔马林 后摇床摇2小时固定效果更好。

样本尺寸

标本的长宽厚应在2cm2cm5mm以内，理想情况下，3 毫米厚的切片在组织固定和处理上最为合适。

固定液体积

固定液的体积至少应该是组织的6-10倍，最理想状态是20倍或更高。

PH值和缓冲液

pH 值可能非常重要，PH值过低，甲醛分解形成甲酸会产生酸性溶液，该溶液又会与血红蛋白反应产生人工色素（酸性甲醛血红素）。现今使用最广泛的甲醛溶液一般缓冲为 pH 6.8 – 7.2。

渗透压

固定剂渗透压对超微结构级别标本固定的影响更大，因为在过度低渗或过度高渗的溶液中，磷脂膜很容易被破坏。高渗和低渗缓冲液分别会导致组织的收缩和膨胀。

固定液的配方

现在多数实验室都买的商品化的固定液，拿来就能用，很方便；不过每个厂家的固定液配方都会有细微差别，进而导致固定效果也不一样。下图是同济医院病理研究所固定液配方。

固定说起来简单，但深入去研究，几篇也说不完，今天暂时就先说到这里。欢迎加下图微信交流，一起学习，共同进步！

当然，看完如果有收获，也欢迎关注转发，我是少峰同学，一个讲干货的实验员！咱们下期见！

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