五分钟学会western blot！/western blot原理讲解

总步骤

SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.蛋白电泳—蛋白根据分子量的发现分开

SDS（负电）-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

分子量大的跑得慢，在胶的顶部。

2、转膜（膜与蛋白有高度亲和的能力）

从胶内部转移到膜表面，更容易和蛋白结合。

常用的两种：硝酸纤维素膜

PVDF（聚偏氟乙烯）膜

蛋白负电，胶和膜之间加一个电场。

滤纸：维持transfer buffer稳定流动。

里面会加甲醇：帮助蛋白更好地与膜结合。使蛋白与SDS分离。

3.封闭—封闭膜的空白结合位点，防止膜与抗体直接结合。阻止非特异性结合。

脱脂牛奶或BSA

4.加抗体，检测

1）一般先加一抗：与蛋白特异性结合。洗膜：未结合一抗洗掉。

2）二抗：被标记了的抗体：可结合多个一抗，放大信号。孵育后，洗去多余的。

HRP：辣根过氧化物酶。