细胞培养（传代，冻存，复苏）

每个人都有自己养细胞的习惯和步骤，此篇仅用来记录我搞细胞的步骤和注意事项

传代

准备工作：

1.超净台紫外照射1h，中途把培养基，PBS，胰酶等喷75酒精后放进超净台一起照紫外

2.打开超净台，玻璃拉到指定位置，3min自净（期间观察细胞状态）

3.75酒精对手部和试验台进行消毒（袖口也可以适当消毒）

4.将枪头盒，移液枪，装有酒精棉球的蓝盖瓶喷酒精后放入超净台（所有进入超净台的东西均需酒精消毒）

5.用酒精棉球擦拭所有需要用到的试剂瓶口（镊子夹紧，旋转几周，封口膜开前开后都要擦拭）

传代开始：

将细胞从培养箱拿出，放进超净台（可以75酒精消毒，但需盖紧，防止酒精进入）

总原则：为了避免污染，非必要不打开皿盖！！！！！！！！！！！！！

1.打开皿盖（将皿盖尽量放到自己接触不到的地方）用移液器或吸痰器将废液吸取干净

2.加入随便2-3ml的PBS洗两次（贴壁细胞，不要把PBS直接打到细胞上，枪头对着皿壁打）

    PBS：磷酸缓冲盐溶液，主要成分为Na ₂HPO ₄ 、KH₂PO ₄ 、NaCl和KCl，由于Na₂HPO ₄ 和KH₂PO ₄ 它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为水盐平衡，不使用蒸馏水的原因在于水会破坏生物蛋白的结构和生物特性。不使用生理盐水的原因在于它不能够调整PH值。

3.加入1ml胰酶消化细胞，每种细胞的消化时长不一致，要自己摸索一下，拍打皿壁（皿底有一层薄雾即为贴壁细胞），在显微镜下观察，细胞簌簌落下即可，加入2ml培养基中和，将枪头吸满液体，从下往上缓慢打出，直至皿底看不见薄雾变光滑，将液体移入离心管中，1000-1500rpm，3-5min即可

期间准备好培养皿（9cm皿）放入8-9ml培养基

4.弃去离心管上清，加入1-2ml培养基重悬（轻轻吹打重悬即可），移入新皿中

5.进行混匀，有8字和十字两种，看自己喜欢选择，然后放入培养箱中

细胞不应放在室温太久，培养基颜色只能表示培养基酸碱性，紫色呈碱性，对细胞有损伤

当它变黄的时候就说明营养物质早就耗尽了，每隔2-3天换一次液

后续工作：

将所有自己的东西带走（公共超净台的话）试剂等需要封口膜封死，枪头盒等也需要盖紧，都搞好才能从超净台拿出来，将废液等倒到指定位置，然后酒精棉球擦桌子，然后关上打开紫外即可

冻存

准备工作同传代

冻存开始  步骤123同传代

4.弃去离心管上清，加入1-2ml冻存液重悬（轻轻吹打重悬即可），移入冻存管中

5.对于即用型无血清细胞冻存液来说，可以直接冻存于-80℃冰箱，长期保存（>5年），不需要程序性降温。24h后可转移液氮罐中。

转移过程：

一般液氮罐操作，一提有很多盒，如果要找其中某盒的东西，时间超过30s-1min，就需要先准备一个泡沫箱，从液氮罐取一点液氮，倒入泡沫箱。

把整提拿出来，拿出需要查找的那盒，放入泡沫箱，把整提先放回去，然后再对泡沫箱中的那盒样本进行查找整理等，弄完之后，再把整提拿出来，把这个盒子放进去，赶紧把整体放回

后续工作同传代

复苏

准备工作同传代

总原则：慢冻速溶

复苏开始

1.准备好培养皿（9cm皿）放入8-9ml培养基

2.将冻存管从液氮或-80冰箱取出，放在37度水浴锅中，一分钟速溶，期间手一直在晃动震荡

3.身边人复苏有好几种方法，我总结了一下

a.将解冻的细胞直接吸取加入培养基中，放进培养箱

b.将解冻的细胞直接1000rpm3-5min离心，枪吸走上清，重悬加入培养基中

c.将解冻的细胞置于离心管中并加入2-3ml培养基一起离心，弃上清重悬加入培养基中

我觉得：还是要根据自己细胞的状态来确定那种方式更好，b方法我觉得有点冒险，a的话冻存液其实会毒害细胞的，我看即用型细胞冻存液不含动物来源性蛋白，不含血清，含DMSO、葡萄糖等各种细胞营养成分，DMSO还是对细胞有伤害的

后续工作同传代