写在前面

    怎么说呢，这个系列就是把自己的homework拿出来晒一晒，也就是图一乐丢人现眼一下，因为本人能力和知识范围有限，难免会有错误，请谅解一下，也就是仅供参考。引文都有标注，如果有侵权的可以联系我。欢迎各位大佬多交流，提问题、指错误。要是能关注一波那就更好了 

浅谈荧光素酶的相关研究

荧光素酶（luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称，生物发光（Bioluminescence）是自然界广泛存在的，由生物产生的一种发光现象。能够产生生物荧光的生物种类繁多，包括发光细菌、发光萤火虫、发光鱼、发光海星、发光甲虫等其中细菌荧光素酶（Bacterial Luciferase，BL）和对萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，FL）的研究是最多最广泛的.目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，且大多数生物无内源荧光，利用荧光素酶基因作为报告基因几乎无背景干扰，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用正愈来愈受到关注。[1-2]

1 荧光素酶研究的发展历程

早在1885年Dubois提出生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应引起的发光现象。1954年，Meclroy等对从哈氏弧菌中提取并纯化出细菌荧光素酶。1967年，Friedland等对从费氏弧菌中提取出的荧光素酶的结构和反应原理进行了分析。1956年，GreenA等提取出萤火虫荧光素酶。在1970年，Denburg等第一次测定了萤火虫荧光素酶的结构。1985年，Dewet J.R.等首次克隆了P.Pyralis的荧光素酶基因，并在大肠杆菌中表达，从中获得了具有活性的荧光素酶。1986年他们又测定了荧光素酶基因的cDNA序列，1986年，Marlene等第一个成功地获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草，荧光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代。[1][3]

2荧光素酶的发光机制

2.1 细菌荧光素酶

不同种类的发光细菌的发光机制是相同的，是由特异性的荧光素酶催化，还原性的黄素（FMNH2）、八碳以上长链脂肪醛（RCHO）、氧分子（O2）所参与的复杂的氧化反应，在450～490nm时发射蓝绿光。

 

与其他酶相同，BL的活性也会受到多方面因素的影响，例如反应中的FMN、RCHO、O2、BL、pH和温度都会影响BL的酶活。还有研究指出，在RCHO缺乏的情况下，荧光素酶也可以催化FMNH2和O2反应，生成FMN和H2O2，但只能发出极其微弱的光。而在RCHO存在的条件下则可以发出持续的、稳定的荧光。[1-2]

2.2 萤火虫荧光素酶

萤火虫荧光素酶催化的发光反应必须要ATP和虫荧光素（Firefly luciferin）的参与。虫荧光素是一种可以被氧化的底物，在ATP，Mg2＋，O2存在的条件下，它在虫荧光素酶的催化下氧化发光，由激发态回到基态同时产生绿光。

影响虫荧光素酶发光强度的因素很多：包括ATP、荧光素、O2、Mg2＋的浓度，pH及反应温度等。[1-2]

3 荧光素酶的应用

3.1 作为报告基因检测系统

 荧光素酶基因（lux）表达的直接结果是产生生物荧光，而且反应非常迅速且易于检测，因而被广泛用于基因操作中，作为标记基因和报告基因来研究基因的转录、表达和调控。荧光素酶报告基因具有检测快、灵敏度高、稳定性好、线形范围广、不损害检测对象、干扰少等优点．

此外虫荧光素酶－海星荧光素酶的双荧光素酶报告系统也为研究RNAi、miRNA、siRNA等提供了工具。[1-3]

3.2 ATP含量检测

ATP既是FL催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。传统ATP测定方法操作复杂，灵敏度低，缺乏足够的专一性。而在FL催化的发光反应中，当ATP在一定的浓度范围内时，其浓度与发光强度呈线性关系，因此，利用荧光素酶测定ATP具有快速灵敏的特点。[2]

3.3 研究蛋白质的相互作用

2002年，R．Paul murugan应用虫荧光素酶对成肌调节因子（MyoD）和细胞分化抑制因子（Id）之间的强相互作用进行了研究．2004年，Sung等也利用这种原理把海星荧光素酶进行了剪切与重聚，研究了雄激素受体在小鼠中的易位作用。荧光素酶为研究哺乳动物细胞中的蛋白质的磷酸化和蛋白之间的相互作用提供了一个新的、可靠的、快速的方法．同样也可以用于研究细胞网络包括信号转导途径，优化用于调节蛋白质之间相互作用的药物．[1]

3.4 环境质量检测

用基因工程改造发光细菌可以进行微生物在水、土壤、空气中分布的研究，还可以用于测定一些化学物质及污染物的毒性、监测河流水质、进行空气质量评价等。

在正常条件下，发光细菌在450～490nm时发出蓝绿色可见光．与被检物（如污水等）接触后，当被检物中具有抑制发光细菌的物质达到一定浓度时，则发光细菌的发光强度将发生改变，其变化的程度与抑制物的毒性大小有关，并与抑制物质的浓度在一定范围内相关在正常条件下，

1994年，Zomer等应用荧光素酶催化的生物发光现象进行水、土壤、食品等样品中有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂的灵敏检测。其原理是昆虫脑提取物中有杀虫剂攻击的受体或酶结合位点，将生物发光的底物——D-Luciferin衍生物渗透至昆虫脑提取物中，昆虫脑提取物能将D-Luciferin衍生物水解为D-Luciferin，添加ATP和FL，即可发生生物发光，而杀虫剂能抑制这种水解活性，通过检测发光强度，即可计算杀虫剂的浓度。[1-2]

4 展望与思考

从19世纪开始到今天，对荧光素酶和荧光素酶基因的研究得越来越深入，其以高特异性、反应速度快、应用范围广等优点在生物学各个领域都有较大的应用。

但由于荧光素酶在溶液中的不稳定性及其来源的局限，荧光素酶的应用的价格比较昂贵，若重头设计荧光素酶，将其合成途径及性质改造得更便于人类利用，在保证现有优势的情况下，变得更加稳定，合成途径更加简便可控，使得荧光素酶的应用范围进一步拓宽。

此外，是否可以利用多种不同的荧光素酶或者设计不同荧光素酶的底物，将其发射波长相错开，在原有的双荧光素酶报告系统上进行改造，实现多角度实时监控细胞内或动物体内的基因多维变化或者基遗传信息传递的动态过程，以此来发现或验证基因的各种协同功能，例如监测不同增强子对同一对基因的相互作用与时空特性。

最后，若将荧光素酶改造并应用于生物传感器或环境监控器，是否可以获得极其灵敏的环境检测器，来测定特定的环境中的污染浓度或者应用于特点疾病的实时监控、特定药物浓度的动态变化等等。

 

参考文献：

[1] 杨颖，张逢春.荧光素酶的分类、结构与应用[J].北华大学学报（自然科学版),2006(05):411-415.

[2] 张菊梅，吴清平，周小燕，郭伟鹏，吴慧清，王元平.荧光素酶研究进展[J].微生物学通报，2001(05):98-101.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2001.05.025.

[3] 胡敬志. 萤火虫荧光素酶的性质和应用的研究[D].华东师范大学，2007.

[4] 刘建武，孙成华，刘宁.荧光素酶及其应用[J].生物学通报，2004(02):15-17.