花点小心思将m6A修饰和ceRNA机制结合，就可以让基础实验轻松发5+
ceRNA机制基础研究过时了？答案是No!稍微小心思就可以将ceRNA机制做出花样，带来高分惊喜。下面小编就跟大家分享一篇基础医学的文章，这篇文章的题目是m6A-induced LINC00958 promotes breast cancer tumorigenesis via the miR-378a-3p/YY1 axis，于2021年发表在Cell Death Discovery上，杂志的影响因子为5.241。
这篇文章将m6A修饰与ceRNA机制结合，思路简单，下面就具体来看下文章的主要结果吧。
1、LncRNA LINCO0958提示乳腺癌患者预后不良
在入组的乳腺癌患者中，检测到LINC00958的表达，并发现其表达显著上调（图1A）。将这些样本按临床分期分为两组，结果显示LINC00958在晚期（III-IV级）的表达高于早期（I-II级）（图1B）。在临床样本的基础上，本研究还检测了乳腺癌细胞系中LINC00958的水平。研究发现，与正常细胞相比，LINCO0958在乳腺癌细胞中显著上调（图1C）。生存分析发现，LINC00958表达水平较高提示乳腺癌患者预后不良（图1D）。
2、m6A诱导乳腺癌细胞中LINCO0958表达上调
在MeRIP-Seq分析中，在LINC00958位点发现了一个显著的m6A修饰位点（图2A）。已有的报道发现，m6A甲基转移酶METTL3可能会LINC00958进行m6A修饰，因此我们假设METTL3可以促进LINC00958的m6A修饰。在乳腺癌细胞系（MCF-7）中，METTL3的表达上调（图2B）。使用METTL3敲低（图2C）转染，m6A定量分析显示，METTL3沉默降低了m6A修饰富集（图2D）。MeRIP-qPCR显示，m6A修饰的LINC00958在METTL3沉默后表达水平下降（图2E）。RNA稳定性分析显示，METTL3沉默可降低LINC00958水平，说明METTL3在乳腺癌细胞中LINCO0958过表达中的作用（图2F）。综上所述，m6A诱导乳腺癌细胞LINC00958表达上调。
3、LINCO0958促进乳腺癌细胞的肿瘤进展
通过功能增加或丧失检测LINC00958在MCF-7细胞表型中的作用（图3A）。集落形成实验（图3B、C）和CCK-8实验（图3D）表明，LINC00958敲低可抑制MCF-7细胞的增殖，LINC00958过表达可促进MCF-7细胞的增殖。流式细胞术分析细胞凋亡发现，LINC00958敲低可加速MCF-7细胞的凋亡，LINC00958过表达可降低细胞的凋亡（图3E）。体内注射了用LINC00958敲低转染的MCF-7细胞的小鼠显示出对肿瘤生长的显着抑制（图3F）。这些结果提示，LINC00958促进了乳腺癌细胞的肿瘤进展。
4、LINCO0958靶向miR-378a-3p
在LINC00958的功能研究中，本研究通过亚细胞分数分析发现LINC00958主要分布在细胞质中，而不是细胞核中（图4A）。使用生物信息学预测工具（StarBase），发现几种miRNAs可能受到LINC00958的调控。在这些miRNAs中，miR-378a-3p与LINC00958有显著的连接(图4B)。荧光素酶报告基因检测发现，miR-378a-3p mimic可以直接与LINC00958结合（图4C）。RT-PCR显示，与正常细胞（MCF-10A）相比，miR-378a-3p在乳腺癌细胞（MCF-7）中的表达下降（图4D）。在MCF-7细胞中，LINC00958敲低转染后miR-378a-3p表达上调（图4E）。这些数据支持LINC00958在乳腺癌细胞中靶向miR-378a-3p。
5、LINC00958/miR-378a-3p靶向YY1
生物信息学预测工具（StarBase）发现LINCO0958/miR-378a3p可以靶向多种蛋白（图5A）。发现YY1是LINCO0958/miR-378a-3p的靶点，构建了荧光素酶报告载体（野生型和突变型）（图5B）。荧光素酶报告基因检测发现，miR-378a-3p mimics与野生型YY1 mRNA紧密结合（图5C）。RT-PCR分析发现miR-378a-3p mimics转染降低了YY1 mRNA的表达，并且miR-378a-3p抑制剂上调YY1 mRNA的表达。此外，LINCO0958基因的下调降低了YY1 mRNA的表达，而LINC00958过表达则促进了YY1 mRNA的表达（图5D）。在MCF-7细胞中，YY1 mRNA表达明显上调（图5E）。Pearson's相关分析显示，在乳腺癌样本中，miR378a-3p与YY1呈负相关，LINC00958与YY1呈正相关（图5F）。这些数据支持LINC00958/miR-378a-3p靶向YY1。
以上就是本研究的主要结果啦，实验方法比较常规。本文的创新点在于将m6A修饰与ceRNA调控机制简单结合揭示乳腺癌发生和发展的分子机制，大家赶紧借鉴起来，注入热点思路提亮文章吧。
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