【综述】高通量测序技术在脓毒症病原微生物检测中的价值—《中华重症医学》

脓毒症是由各种病原微生物感染引起的危及生命的脏器功能障碍综合征。近年来，脓毒症发病率逐年升高，成为重症医学科（intensive care unit，ICU）临床工作的巨大挑战，全球每年脓毒症患病人数超过1900万，其中有600万患者死亡，病死率超25%。致病微生物的快速准确鉴定，对帮助临床医师尽早开展目标性治疗及优化药物治疗方案尤为重要，是改善患者预后、降低病死率的重要保障。但由于临床诊断技术层面的局限性，常有40%~50%的脓毒症患者不能明确病原微生物，导致初始治疗延迟或失败，病死率显著增加。

长期以来，微生物培养一直是脓毒症诊断和疗效监测的常规病原学诊断技术，但该技术存在缺点：临床实验室一般只能进行细菌/真菌培养，并且培养周期较长（3~7 d）；且培养阳性率低（30%~40%）。虽然可以通过反复培养增加阳性概率，但同时也增加了患者经济负担，并可能延误正确治疗的时机。基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的病原学检测技术只能对已知病原微生物进行检测，其结果的解释高度依赖临床经验，可能对结果的准确性造成影响。血清降钙素原、C反应蛋白及内毒素等分子标志物在脓毒症诊断中有一定价值，但这些指标受多种因素干扰且不能明确具体病原微生物，对于临床抗菌药物选择指导价值有限。因此，以上常规诊断方法存在敏感度低、时效性差、误差大和鉴定信息不全等缺点，且往往对临床未知或罕见的病原微生物无法识别。因此，迫切需要一项快速、准确、经济的方法可同时鉴定各种临床病原微生物的技术普及实施于临床。

一、高通量测序技术

近年来，新兴的高通量测序技术（又称二代测序技术）可以使病原体在检测前不需培养分群即可直接测序鉴别，具有检测速度快、准确率高、覆盖范围广等特点，并越来越多地应用于临床，显示出良好的临床实用发展趋势。高通量测序技术主要是将通用接头连接到要测序的片段化基因组DNA，然后使用不同的方法产生数千万的单分子多克隆聚合酶链反应阵列，然后进行大规模的引物杂交及酶延伸反应，这些反应可以在几十万甚至几百万的序列上同时进行，并且可以同时检测反应后每个步骤产生的信号，通过计算机分析获得完整的DNA序列信息。此外，它还可以对脓毒症合并血流感染患者血液中的血浆游离DNA进行无偏序分析，这被证实可以用于血流感染的诊断。

二、高通量测序技术检测脓毒症病原体的优势

1．测序通量高、敏感度较高

与PCR诊断技术相比，高通量测序技术无需特定的引物设计，直接提取标本中的全部核酸片段并加以检测，经生物信息学分析即可鉴定出标本中所含核酸的种类，并可获得病原体的序列数、覆盖度等定量分析数据，识别临床常见和罕见感染性菌株或突变株，最大程度地避免了漏检。与常规微生物测定结果相比，在鉴定某些病原体（人类偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、嗜麦芽单胞菌、人类疱疹病毒6型和巨细胞病毒）方面显示出了100%的敏感度，显著提高了病原体检出率。

Long等对ICU的78例脓毒症患者血浆样本进行高通量测序和血培养两种方法检测分析，并选择10名健康志愿者的血浆样本作为阴性对照，结果发现，就细菌/真菌而言，8份标本测序及培养均阳性，3份标本测序阴性而培养阳性，9份标本测序阳性而培养阴性，总诊断敏感度由培养的12.8%（10/78）提高到高通量测序的30.8%（24/78）。在Parize等的前瞻性研究中，比较了高通量测序技术和常规微生物检测方法在免疫缺陷成年人感染中的应用情况，对其血样和部分鼻咽拭子及体液样本进行分析，并对患者进行了30 d的随访，研究结束时对两种方法的结果进行了与临床相关的病毒和细菌检出率的评估，发现在纳入的101例样本中，72例样本使用两种检测方法的结果一致，但高通量测序技术检测到临床相关的病毒和细菌的比例明显高于常规方法。

2．早期识别病原体，时间短

基于测序技术的临床宏基因组学，不依赖于培养技术，直接获取临床样本（血液、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液等），应用高通量测序分析临床样本中微生物的DNA或RNA含量与丰度判断病原菌，利用生物信息分析软件全面鉴定细菌、病毒、真菌、寄生虫。因此，该技术可一次性对几百万到几十亿条DNA分子进行并行测序，检测种类可覆盖上千种病原微生物，通常在2~3 d得出检测结果，获得疑似致病微生物的种属信息。

3．检测特殊病原体，弥补传统检测技术缺陷

高通量测序技术在病原微生物检测应用方面具有独特的优势，可实现对未知疾病相关微生物的快速鉴定，已经成功应用于H1N1病毒基因组的发现和腺病毒分型等。Abril等首次通过高通量测序技术在脓毒症休克患者血浆中检出犬咬二氧化碳嗜纤维菌，并通过血培养和16S rRNA测序证实。真菌感染导致的脓毒症不断增加，但基于培养的检测方法具有一定的局限性。Decker等纳入50例脓毒症休克患者，连续使用真菌培养、高通量测序、血浆中β-D-葡聚糖等方法进行检测，结果提示高通量测序技术适合用于真菌脓毒症患者和血培养阴性患者的真菌鉴定，可以一定程度上弥补传统真菌培养的缺陷。波瓦桑病毒是一种新的由蜱虫传播的黄病毒属的嗜神经性RNA病毒，Piantadosi等通过高通量测序快速识别引起重症中枢神经系统感染的该病原体，并通过血清学检测得到验证。1例神经系统钩端螺旋体感染的患者在6周内进行了38项感染病原相关检测（包括脑组织活检），均未发现病原体，但通过脑脊液的高通量测序检测，48 h后得出检测结果为钩端螺旋体序列数475条（测序序列数占比为0.016%），并通过PCR和血清学检测进一步确认了该患者罹患钩端螺旋体感染。

猪疱疹病毒又称为伪狂犬病毒，以猪为天然宿主，在人类中虽有疑似病例报道，但却没有确诊病例。最近赵伟丽等报道的基于北京协和医院神经科牵头的脑炎多中心临床登记研究，收集4例疑似猪疱疹病毒脑炎病例，对2例患者进行脑脊液高通量测序，检测到猪疱疹病毒，其他病原体核算检测均为阴性，并对其中3例患者进行血清学检测，发现猪疱疹病毒抗体均为阳性，证实了猪疱疹病毒脑炎诊断。复旦大学华山医院张文宏团队[21]通过高通量测序检测并确诊1例玻璃体中存在猪疱疹病毒感染的眼内炎，得到PCR和血清学试验验证，并揭示了猪相关污染物暴露与猪疱疹病毒感染的可能相关性。由此证实了高通量测序技术对中枢神经系统感染和眼内炎的快速精准诊断价值。

肺孢子虫肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）是免疫功能低下患者的常见感染，病死率高，早期快速诊断对患者预后至关重要。Zhang等报道了13例高通量测序鉴定出肺孢子虫，并且经临床评估证实肺孢子虫肺炎诊断的患者，其中，8例肺泡灌洗液标本中仅有4例Wright-Giemsa染色结果阳性，13例患者仅有1例痰标本镜检阳性。该作者认为，与常规方法相比，高通量测序诊断PCP的阳性率令人满意，并且该作者尤其强调，3例无法承受或拒绝支气管镜检查的患者，通过鉴定外周血样品中的卡氏肺孢子虫测序读数，被诊断为PCP，这表明高通量测序可能被视为未来诊断PCP的非侵入性工具。

临床工作中，如遇到病原学诊断不明或高度怀疑特殊病原体感染的患者，使用常规检验方法难以有效查出病原体，则可考虑送检高通量测序检查。依据笔者经验，条件允许可采集血液标本与感染部位标本一并送检，如二者高通量测序检查均查见相同病原体核酸，指导价值较高。

三、高通量测序技术检测脓毒症病原体中存在的问题

1．难以有效分辨致病菌和背景菌

尽管高通量测序技术敏感度较高，但其检测结果往往难以有效区分污染菌、定植菌还是真正的致病微生物。高通量检测结果是一个病原体列表，可能同时呈现多项阳性结果，临床医师难以仅仅依靠测序结果确定真正的病原菌，因此，检测结果需要跨学科的全方位解读。Grumaz等通过序列数绝对值及偏离正常的程度计算"脓毒症导向量化指数"（Sepsis Indicating Quantifier score，SIQ score），对每个样品中检测到的每一个微生物进行定量和概率评估，协助判断。该研究团队目前正在尝试进行大样本的前瞻性多中心研究来进一步验证SIQ的临床价值。

2．技术和数据库的标准化问题

高通量测序技术在我国临床病原诊断中尚未普及，现有检测机构的测序方法，不仅生物信息算法存在差异，并且所用的数据库也有所不同，导致在病原菌鉴定以及相对丰度计算方面出现差别。在高通量测序技术生物信息分析流程缺乏统一标准的情况下，研究人员基于个人经验、可及性以及简便性选用分析软件，会对病原检测结果的可重复性及准确性造成影响，成为高通量测序临床应用标准化的障碍。

3．难以有效监测耐药基因

对于细菌或真菌感染，病原体耐药基因检测有助于临床医师根据患者病原体耐药和病情进展制订个性化治疗方案。但目前研究中检测到的细菌、真菌的基因组覆盖率较低，大多情况下并不能有效检测耐药基因，仅有少数含菌量很大的样本或者对培养出的菌落进行测序才能较好地检测到耐药基因。另外，细菌的耐药基因型与表型未必一致，因此临床用药仍需要经验性选择，或参考药敏试验结果。高通量测序技术对耐药基因的检测仍是目前研究的热点和难点问题。

4．价格昂贵

高通量测序技术作为新型的基因检测技术，技术更新速度快，尚缺乏完善的标准规范管理和适用于临床的消费监管体系。目前的检测费用近4000元/样本，远高于临床常用的其他病原学检测技术价格。

四、展望

高通量测序技术用于脓毒症病原微生物检测正处于临床应用的发展阶段，有广阔的临床应用空间，但也面临着诸多挑战。如标本的规范化采集、生物信息分析流程的参考标准、检测报告的专业性解读及检测结果如何指导临床治疗等问题。但该检测技术一直朝着积极的方向发展，临床医师应在认识到高通量测序的临床使用价值及复杂性的前提下，积极开展规范化的临床应用研究，使该技术能够成为脓毒症及感染病原学早期诊断的可靠工具，促进精准医学的发展。

【引用本文】: 许娜娜, 周敏, 尹梅, 等.  高通量测序技术在脓毒症病原微生物检测中的价值 [J/CD] . 中华重症医学电子杂志,2019,5( 2 ): 199-202. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2096-1537.2019.02.021