16S+LC-MS代谢组学助力分析发酵饮料ogi中细菌菌群和真菌毒素

前言

2021年02月，伊犁山雷莫巴布科克大学的Ihuoma E. Chibuzor-Onyema教授课题组在FOOD RESEARCH INTERNATIONAL期刊发表的题为 “Metataxonomic analysis of bacterial communities and mycotoxin reduction during processing of three millet varieties into ogi, a fermented cereal beverage ”的研究成果，通过16s rRNA测序、LC-MS代谢组学研究方法，发现了谷物中细菌群落和霉菌毒素特征，探究了谷物在加工成ogi过程中真菌毒降低的机理，描绘了ogi中菌群结构图谱。为寻找低污染、安全的代替食品提供了理论依据。

中文标题：三种谷物加工成发酵饮料ogi过程中细菌群落和真菌毒素减少的宏分类分析

研究对象：谷物

发表期刊：FOOD RESEARCH INTERNATIONAL

影响因子：6.475

发表时间：2021年02月

合作单位：伊犁山雷莫巴布科克大学

运用生物技术：LC-MS靶向代谢组学、16s rRNA基因测序

研究背景

Ogi主要是由玉米制成的发酵饮料，但很少用谷物制成，而谷物在生产过程中的细菌群落和真菌毒素尚不清楚。文章采用16s rRNA高通量基因测序和LC-MS靶向代谢组学进行研究，表明谷物在加工阶段的细菌群落显著分化，真菌毒素明显降低。

研究思路

研究方法

1. 实验分组/研究材料

  （1）WF；D.exilis：2kg

（2）BF；D.iburua：2kg

（3）FM；E.coracana：2kg

2. 技术路线

2.1 理化方法：pH计测定pH值；酚酞指示剂测定TTA

2.2生物技术：16S rRNA基因测序

2.3 LC-MS靶向代谢组：测定谷物及ogi中6种真菌毒素

3. 统计分析

3.1 生物信息学分析：FastQC软件、DADA2去噪器、Silva 16S rRNA分类法、QIIME2软件

3.2 细菌群落数据统计分析：R 软件、GraPhlAn软件

研究结果

ogi生产过程中的物化性质

三种谷物浸泡期间，pH值均降低分别为WFpH 5.1至pH4.1，BFpH 5.4至pH4.2，FM pH5.9至pH5.1（图1a）。变酸阶段，谷物品种发酵成ogi的pH值在24小时急剧下降至pH3.5（WF为pH3.4），在变酸72小时达到pH3.5（WF和BF）和pH3.4（FM）（图1a）。ogi在变酸期间，TTA也相对增加，在72小时最高（图1b），其中FM中的TTA最高为0.83%。

图1 | 三种谷物发酵（浸泡和变酸）成ogi期间的pH值和TTA

ogi生产发酵阶段相关的细菌ASV

2.1 ASV的多样性和动态性

样本获得的16S rRNA序列、物种丰富度（Chao1）和ASV数量（ASV丰富度，R）能够描述细菌多样性。谷物浸泡阶段，FM中ASV的R和多样性最低，发酵12小时的BF有最高的ASV丰富度（R）和H'值，WF中的R和H'值始终较高。变酸期间FM的R和H'值最低，变酸48小时能观察到最高的R和H'值。谷物在浸泡和变酸期间的R和H'的趋势都是不同的。浸泡期间，WF的R和H'水平在前36小时升高， 48小时后降低；FM的R和H'水平降低；BF出波动模式。变酸期间，FM的R和H'水平在72小时内增加，BF的R和H'水平在48小时前增加，72小时下降；WF的R和H'水平在24小时前增加，然后在变酸结束前降低（表1）。  

  

表1 |三种谷物发酵成ogi过程中ASV的多样性

谷物在每个采样时间点特有的ASV数量高于两个或多个时间点之间共享的ASV数量（图2a-c和2e-g）。浸泡期间，WF在四个采样时间点有最多的ASV（图2a）。WF和BF变酸期间，四个采样时间点ASV数量都较高（图2e-g）。变酸结束时，三种谷物ogi的ASV数量都是不同的（图2d和图2h）。

图2 | 三种谷物发酵至ogi期间的采样时间点/间隔中常见ASV/物种

2.2 细菌群落组成

BF和FM的细菌群落组成密切相关，浸泡过程中与WF的细菌群落组成不同。多变量空间中观察，谷物品种之间的差异是显著的。成对后Hocpermanova分析表明，只有FM和WF之间存在显著差异（图3a和图3c）。WF和BF变酸期间的细菌群落组成密切相关，但与FM不同（图3b和图3d）。多变量空间中，FM和BF之间及FM和WF之间微生物群落存在显著差异。多变量分析表明，近亲谷物品种WF和BF的群落组成相似，尤其是在变酸期间，不同于远亲谷物品种。

图3 | 浸泡和变酸阶段的非度量维标度图及UPGMA层次聚类树状图

2.3 优势物种和丰度差异

ASV共有16个门，包括放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门和变形菌门等。三种谷物在发酵过程中，厚壁菌门占主导地位。WF浸泡过程中，拟杆菌门在浸泡开始12小时占主导地位，厚壁菌门在浸泡结束时占主导地位（图4a）。谷物样本中鉴定出43种主要类型菌，而这些乳酸菌构成ogi加工过程中的核心发酵微生物（图4b）。

样本中检测到的43个优势属中，丰度差异测试显示有15个属。狭义8型梭菌属、棒状杆菌属和链球菌属差异较多。发酵过程中，BF中的新鞘球菌和小球菌也比其他样品组更丰富。WF中的弯曲杆菌和邓加内拉菌的含量高于其他样品。其余8个差异丰度属，WF比其他样品的丰度差异更高（图4）。

图4 | 占优势的系统类型相对丰度

谷物加工成ogi过程中的真菌毒素减少

谷物及ogi中测定了曲霉、镰刀菌和青霉菌产生的6种主要真菌毒素，在FM、BF和WF中分别检出1种、3种和6种真菌毒素。生谷物中的真菌毒素水平通常较低，但高于在72小时变酸时的ogi。生谷物加工成ogi后，WF、BF和FM的真菌毒素减低百分比分别在52.1%-100%、57.6%-100%和100%。WF中的黄曲霉毒素B1减少100%，桔霉素和玉米赤霉烯酮减少百分比分别为100%和76.3%。白僵菌毒素是在三种谷物中均出现的真菌毒素，降低的百分比也很高（表2）。

表2 |三种谷物加工过程中真菌毒素的降低水平

相关讨论

谷物变酸是确定最终产品的决定性阶段，完全去除潜在的有害微生物，可能会促进微环境中的抗菌化合物。发酵利用系统16S rRNS测序微生物群的多样性，通过细胞壁结合、降解或生物转化等方法来减少真菌毒素。Ogi和谷物中的真菌毒素降低，可能不会对健康构成风险。发酵过程中涉及的细菌种类可作为益生菌加以利用，通过发酵培养提高以谷物为基础的ogi生产技术。

研究结论

本篇运用16S rRNS测序及LC-MS代谢组学研究表明，由谷物制成的ogi菌群具有多样性，且真菌毒素显著降低。而文章选用的三种谷物中，尤以FM品种对ogi加工阶段影响最大。通过数据和食品方面分析，谷物品种优于玉米，是一种可行的替代品。

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本片文章通过LC-MS靶向代谢组学和16S rRNA基因序列分析，探究谷物在加工传统饮料ogi过程中真菌毒素的减少和细菌群落的动态变化。同时，从粮食安全方面考虑，谷物的污染水平低、较安全，又优于玉米，可以代替受真菌毒素污染的玉米品种。

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本文系鹿明生物原创