基于挥发性GC-MS代谢组学分析忍冬品种之间的花香调控机制
前言
在植物中，花的气味在吸引传粉者、阻止病原体和寄生虫以及响应生物和非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用。此外，花香是观赏植物的重要商业性状，对食品、饮料、香水、化妆品和制药行业的质量也具有重要的经济价值。
花香由挥发性有机化合物的混合物组成，挥发性有机物具有亲脂性，分子量低，熔点高。迄今为止，已鉴定出1700多种花的挥发性有机物，可分为萜类、苯丙类/苯类、脂肪酸衍生物和氨基酸衍生物。在过去的十年中，大量关于花挥发性有机物的研究提高了作者对其功能、生物合成和调控的理解。目前，对花香的研究主要集中在常见的观赏植物上，如玫瑰、兰花和郁金香。然而，不同植物的花香中挥发性有机物的成分和丰度差异很大。
忍冬属刺叶科，是一种重要的中药植物。粳花（LJF）因其药用和甜味特性被广泛应用于医药、化妆品、饮料和食品中。人们对LJF的药理活性的研究已经付出了大量的努力。然而，花香的调节机制尚不清楚。
2022年9月，河南师范大学生命科学学院李建军课题组在《Frontiers in Plant Science》期刊（IF:6.627）发表了题为“Integrated volatile metabolomic and transcriptomic analysis provides insights into the regulation of floral scents between two contrasting varieties of Lonicera japonica”的研究成果，本研究采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱法对两种不同品种粳花（LJF）在香气最强期的挥发性有机物进行了鉴定。此外，还通过转录组学谱与代谢组学数据进行了相关性分析，以阐明LJF的花气味的调控机制。选择候选基因进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行验证。这些发现为LJF的花气味的代谢机制和分子基础提供了新的信息。
研究思路
图1 | 代谢组学和转录组学工作流程概述
研究结论
1.两个品种的代谢组分析
为了解可能导致这两个品种的LJF香气差异的原因，作者使用HS-SPME结合GC-MS代谢组学来鉴定LJF在银阶段（香气最强的阶段）的‘Yujin 2’和‘Fengjin 1’。对不同QC样品的总离子电流进行重叠分析，发现气相色谱-质谱分析具有良好的仪器稳定性（图2A）。Pearson的相关分析显示，“Yujin2”和“凤金1”样本之间的相关性较弱，而重复样本内的相关性较强（图2B）。主成分分析还表明，两个品种的VOC谱是分离的，生物学上的重复相同品种被紧密地分组（图2C)。这些结果表明，代谢组数据具有较高的可重复性，便于进一步分析，且两个品种的VOC谱不同。
图2 | 代谢组学分析概述
通过GC-MS代谢组学研究表明，两个不同品种之间的LJFs的挥发性有机物水平有很大的差异。共鉴定出153个数据库，其中增加41个，减少112个（图3A）。Yujin2诱导的dav多为萜类和酯类。然而，‘Yujin2’中碳氢化合物、醛类、卤代烃等dav的含量下降（图3B）。为了评估dav的积累模式，作者进行了层次聚类分析，结果显示，dav被分为两个聚类（图3C）。此外，利用KEGG数据库对这些DAVs进行了功能注释，以进一步了解DAVs的生物合成机制(图3D）。
图3 | ‘Yujin 2’和‘Fengjin 1’LJF样品中差异积累挥发物（DAVs）的表征
2.两个忍冬品种ljf的转录组学分析
PCA和Pearson相关分析显示，LJF的转录组学数据是相同品种的，共鉴定出9523个基因，‘Yujin2’与‘Fengjin 1’相比，其中4715个基因上调，4808个基因下调(图4C）。通过对DEGs进行层次聚类分析，并将DEGs分为两个聚类(图4D）。从生物学过程来看，上调的DEGs主要参与细胞壁组织、果胶分解代谢过程、花粉管生长的调控、pH的调控、碳水化合物代谢过程等。在下调的DEGs中，大部分在调节防御反应、极性核融合、光合作用、谷胱甘肽代谢过程等方面富集(图4E)。值得注意的是，与萜类和多酮类代谢相关的油菜素类内酯生物合成、单萜类生物合成和类胡萝卜素生物合成显著富集（图4F）。
图4 | ‘Yujin2’和‘Fengjin 1’LJF样本差异表达基因（DEGs）特征
为进一步研究LJF花香中与VOC产生相关的转录因子，利用这些差异表达的转录因子构建了转录因子和花香味相关基因的调控网络(图5)。
图5 | 一个转录因子（TFs）和花的气味相关基因的调控网络
3.LJF中VOC积累的综合挥发性代谢组和转录组分析
为了获得可能参与LJF VOC生物合成的候选基因，作者通过相关分析整合了转录组数据和VOC谱分析数据(图6A)。总共有12个DAVs对DEGs有较高的校正，包括香叶醇、和反香叶酰香叶醇等。通过KEGG分析，将“Yujin2”和“凤金1”之间的deg和DAVs整合到与VOC相关的通路中生物合成，包括倍半萜和三萜生物合成、萜类主干生物合成、类固醇生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、色氨酸代谢、单萜生物合成和二萜生物合成（图6B）。
图6 | LJF中VOC积累的综合挥发性代谢组和转录组分析
4.LJF中萜类生物合成相关基因的特性研究
运用qRT-PCR验证参与萜类生物合成的候选基因的表达模式(图7）。结果表明，与‘Fengjin 1’相比，‘Yujin2’中有7个基因表达上调，而1个基因表达下调，这与转录组学分析显示的趋势相似。这些被验证的基因包括DXS，1-脱氧-d-木黄糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）和香叶基香叶酰二磷酸合酶（GGPPS），参与2-c-甲基赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径，以及四个参与甲戊酸（MVA）途径的四个基因，包括HMGCS、HMGCR、MVK和AFS1。
图7 | 基于实时荧光定量PCR的萜类生物合成途径相关候选基因的表达分析
研究结论
(1) 调控TFs（MYB、WRKY和LFY）介导VOC生物合成途径相关基因转录；
(2) MEP途径中TES和GGPPS的激活，包括-松果醇和香叶醇；
(3) 促进MVA途径中的HMGCS、HMGCR、MVK、FPS和AFS1；
(4) 上调三萜生物合成途径中的SQE1和LUS和几个参与植物甾醇生物合成的基因；
(5) 下调苯类化合物的生物合成和积累；
(6) 色氨酸和邻氨酸甲酯的生物合成途径升高；
(7) 上调脂肪酸衍生物生物合成途径的基因，促进挥发性C9和C6醛、醇类和酯的积累。
小鹿推荐
本研究培育了一个优良品种的粳稻，并运用转录组+代谢组学联合数据的综合分析得到萜类化合物、倍半萜、色氨酸及其衍生物和脂肪酸衍生物是“Yujin2”比“凤金1”香气更强的主要原因。此外，运用实时荧光定量PCR对参与萜类生物合成途径的几个基因进行了表征。这些结果为了解LJF中花香的代谢机制和分子基础提供了见解，并为进一步筛选与花香调控相关的基因提供研究基础，此研究将有助于培育品质优良、更香的观赏和功能性饮料和化妆品品种提供思路。
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