细胞培养基本技术及细胞传代培养---细胞生物学实验

实验原理

贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就要进行传代。传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。

实验器材

材料：培养瓶，移液枪，吸头，吸管， 75%酒精棉球，酒精灯，Hela细胞。

药品：培养基(DMEM)，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，Hanks液。

仪器：C02培养箱，倒置显微镜，超净台。

实验步骤

1．进无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3．超净台台面应整洁，用0.1%新洁尔灭溶液擦净。

4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。

5．关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。点燃酒精灯。

6．将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7．倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2—3mLHanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶洗一下。

8．每个培养瓶加入1mL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(2～4mL/瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

实验结果：

注意事项

1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。

2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的PBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基等。