生物化学整理真题之实验设计

2007（最后一题）实验设计

A

原因：

1，大肠杆菌被污染长了杂菌。

2，制作固体BL培养基的时候温度还没下降就加入了抗生素，导致抗生素失活。

3，未加抗生素或抗生素失活。

目的：

1，说明了大肠杆菌是否有问题。

2，说明了抗生素是否有问题。

B

原因：

1，抗生素使用错误（抗生素用成了其他种类）。

2，抗生素浓度高。

3，涂板时玻璃棒太烫，或其他原因导致大肠杆菌全部死亡。

4，没转进去。

目的：

1，说明大肠杆菌正常。

2，载体的抗性与其使用的抗生素是否相符。

C

对照三目的：检查DNA连接酶是否有问题。

对照四目的：检测实验中载体自连的几率，碱性磷酸酶可大大降低载体自连率。

2007生化简答

核酸的紫外吸收有何特点？实验中如何用这一特点研究核酸？【三版上册P507】

答：

（1）、核酸中的碱基具有共轭双键，因而使其具有紫外吸收的性质，最大吸收峰在260nm附近，不同的核苷酸有不同的吸收特性。

（2）、利用核酸的此种性质可以用紫外分光光度计加以定性和定量测定。

①　根据260nm和280nm的吸光度的比值可以判断核酸的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯RNA的A260/A280应达到2.0。样品中如若含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值会明显降低。

②　对于纯的核酸样品，可以根据260nm的吸光度（A）即可算出含量。通常以A值为1相当于50μg/mL双螺旋DNA或者40μg/mL单链DNA（或RNA），或者20μg/ml寡核苷酸计算。对于不纯的样品，可以用琼脂糖凝胶电泳区分出条带后，经过溴化乙锭染色在紫外灯下粗略估其含量。

③　测定核酸的摩尔磷吸光系数可以判断DNA试剂是否变性或者降解。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸，据此先测定核酸溶液中磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数ε（P）。核酸的ε（P）值较所含核苷酸单体的ε（P）要低。单链核苷酸的ε（P）值比双螺旋结构的要高，所以核酸发生变性时，ε（P）值升高，此现象为增色效应。复性后ε（P）又降低，此现象称为减色效应。这是因为双螺旋结构使得碱基的π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收。

2008生化问答第三题

假设一个细胞膜表面糖蛋白的一个三糖单位在介导细胞与细胞黏着中起着关键作用。设计一个简单的实验以检验这一假设。

首先分析该三糖单位与蛋白质氨基酸残基的结合位点，然后采用定点突变技术置换该位点的氨基端残基，使糖链不能结合上去。若此时，细胞之间不能黏着，则可证明该三糖单位在介导细胞与细胞黏着中起关键作用，若细胞仍黏着，则不起关键作用。

2008生化问答第五题

设计一个实验方案来验证你所研究的一个蛋白质A在大肠杆菌中是否有表达。【三版上册P278】

答：

方案一：免疫印记测定（western blot）

步骤：制备可能含有目的蛋白质A的待检样品，对其进行凝胶电泳分离，然后再将凝胶上的蛋白条带转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜封闭，然后相继用第一抗体、酶标第二抗体以及底物（或者放射性同位素标记的二抗）进行处理。只有含有待测蛋白的条带显示颜色（或放射性自显影法检测），以此来判断蛋白A是否表达。

方案二：ELISA（酶联免疫吸附测定）

原理：以待测定抗原（或者抗体）和酶标抗体（或抗原）的特异性结合反应为基础，然后通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）的含量。

步骤：1、制备可能含有目的蛋白质A的待检样品，将其吸附到惰性表面（一般是96-井的聚苯乙烯塑料板）。2、加入非特异性蛋白质一起温育，封闭未被蛋白质覆盖的惰性表面，以防止随后的步骤中的蛋白质被吸附到表面。3、然后用抗蛋白A的抗体（第一抗体）处理。4、未被结合的抗体用缓冲液洗去，表面用抗第一抗体的抗体（第二抗体）处理，二抗与一个催化形成有色产物的酶共价连接。5、未被二抗结合的抗体洗去。6、最后加入与第二抗体偶联的酶的底物，根据判断有色产物形成有无来判断蛋白A是否表达。

方案三：RNAi技术

根据蛋白质A，设计相应的siRNA，转化后看大肠杆菌是否存在相应功能缺失。

（其他略有相关性的方案包括：蛋白质芯片技术、免疫电镜、免疫荧光等。）

2009生化问答第九题

简述核酸分子杂交的基础和应用

应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA或RNA片段，按照碱基互补关系形成杂交双链分子。

核酸分子杂交作为一项基本技术，已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛的应用，而且在临床上的诊断中的应用也增多。目前已应用于多种遗传病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中。

2009生化问答第十题

简述2-3种检测蛋白质间相互作用的方法。

蛋白芯片技术：将各种蛋白质有序的固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光染料的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。

免疫共沉淀技术：用抗体将相应特定蛋白沉淀的同时，与该蛋白特异性结合的其他蛋白也会被带着一起沉淀出来的技术。

(1)免疫共沉淀(ColP)实验的原理与过程

免疫共沉淀(CoIP)实验的原理

免疫共沉淀(CoIP)技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体(多抗或标签抗体)免疫沉淀X,在体内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。

2,免疫共沉淀(CoIP)实验的过程

a，将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上

b.将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中

d.若靶蛋白与待筛选蛋白发生了相互作用，待筛选蛋白质就通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离。

酵母双杂交系统

基本原理

a，把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子DNA结合结构域(BD)编码区的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，准备作为 诱饵 捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。

b.将已知的编码转录激活结构域(AD)的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接，获得猎物载体，转化含有 诱饵 的酵母细胞，一旦酵母细胞中表达的 诱饵 蛋白与 猎物 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。

c.分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的 猎物 载体，就能得到与已知蛋白相互作用的新基因。

应用:

a，用于研究蛋白质之间的相互作用

b，用于发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

c.用于在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

d.用于疾病发生机制的研究和药物的开发

e，用于建立基因组蛋白连锁图

f，用于确定蛋白质相互作用的结构域或活性位点。

蛋白质Pull-down的实验原理

利用GST与谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。利用重组技术将探针蛋白与GST融合，将融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上。当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时就可被吸附而分离，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选出相应的目的蛋白。

(2)蛋白质Pull-down的主要步骤

1,GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育，包括a，单一明确的重组蛋白b，细胞裂解蛋白混合液c，体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白。

2,混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠在4℃反应2h，离心得沉淀。

3,沉淀加入Loadng Buffer煮沸3min，高速离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳。

4,考马斯亮蓝对SDS-PAGE胶进行染色，观察特异沉降的蛋白带，接着进行质谱分析确定沉降的蛋白;或对电泳后的胶做western Blot来确定沉降的蛋白中是否含有目的蛋白。

2010最后一题

研究蛋白质与染色质DNA相互作用方法主要有哪些？简述其中一种的原理和流程

(1)研究蛋白质与DNA相互作用的方法

凝胶阻滞(EMSA)实验、DNase I足迹法、酵母单杂交技术、染色质免疫共沉淀(Chip)技术、甲基化干扰试验和体内足迹试验等。

(2)酵母单杂交系统

酵母单杂交系统是用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用的方法，可通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。

1.原理

真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游，把报告基因连接到Pmin下游，然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。

2.步骤

a. 构建报道子载体。将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最基本启动子(Pmin)的上游，把报告基因连接到Pmin下游。

b. 筛选含有报道子载体的酵母细胞。将构建好的报道子载体转化酵母细胞并筛选合适的3-AT浓度。

c. 构建cDNA表达文库。将样品经过一定处理之后，提取mRNA,经过反转录获得cDNA.

d. 筛选cDNA融合的表达文库。将报道子、cDNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的SD培养基上筛选阳性克隆。

e. 对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆。

f，对获得的阳性克隆进行测序。

2010简答第三题

获得一个新基因，如何研究该基因的功能。

1，分析该基因的序列，根据其mRNA序列，找出其CDS区。

2，根据其CDS区序列，设计siRNA序列，由公司合成（同时合成NC，即无关序列）

3，将siRNA和NC分别转入该基因所发现的细胞中，36小时后提取总RNA，及蛋白（蛋白裂解液中加入一定量的蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，PMSF）

4，吸取一部分的RNA,反转录成为cDNA。根据该基因CDS区设计实时定量PCR引物，对其基因进行定量分析，确定其siRNA干扰效果。

5，将剩余的RNA和总蛋白质送至公司进行转录组测序分析和蛋白质组测序，从转录水平和翻译水平比较siRNA组和NC组存在的差异。推导出该基因对哪些下游通路有影响。

6，转染，36小时后测流式（凋亡，周期，增殖）判断其对细胞有怎样的影响，从而推导出对组织的影响。（若是癌细胞，则重点看其对周期的影响。）

7，验证测序结果的准确性。

8，做相关功能蛋白的western blot。比如奶牛的乳腺上皮细胞主要功能是泌乳，则需检测乳蛋白，酪蛋白的表达量。可用酶联免疫吸附法检测处理36小时后的细胞培养液上清中相应蛋白的表达量。

2011年简答题第五题

某研究生将一基因导入植物细胞A检测该基因整合到植物基因组。B。检测该基因表达mRNA。C.检测该基因表达蛋白质。分别用什么方法检测。

A荧光原位杂交：首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过和荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。

B.原位杂交：提取RNA，反转录为cDNA。根据该基因的CDS区设计实时定量PCR引物。以未导入该基因的样本为对照组，进行实时定量PCR扩增，用∆∆t方法分析结果，若存在显著性差异，则认为该mRNA有表达。

C.以为未导入该基因的植物为对照，提取蛋白，加入蛋白上样缓冲液，100℃加热五分钟，充分变性，进行Western Blot实验。最后进行蛋白灰度分析，若实验组（导入该基因）和对照组（未导入该基因）存在显著性差异，则认为该基因蛋白已表达。

2011问答题第4题

请试述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理。

被测蛋白只能与标记的特异性抗体相结合，而这种结合不改变该蛋白在凝胶电泳中的相对分子质量。经SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，封闭固相载体未反应的位点。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影检测被测蛋白。

2012年问答题第一题（同2011年，四，1）

DNA分子克隆：将DNA的限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子。

重组DNA的基本步骤：

1，培养细胞，确定该细胞中该基因的确表达

2，提取RNA，提取过程防止污染

3，反转录成为cDNA

4，设计引物，进行PCR扩增（引物两端应该加上不同的酶切位点以及保护碱基。）

5，对PCR产物进行纯化回收

6，酶切：对纯化回收后的产物和载体（即质粒）进行酶切

7，纯化再回收

8，连接：加入适量的buffer和T4连接酶，酶切后的目的片段和载体，在酶的最适温度下进行连接（目的片段与载体的质量比3~5：1最为合适）

9，用冷热激法转化大肠杆菌感受态，加入1ml的不含抗生素的液体lb培养基，在37°C的条件下摇动1小时。

10，将浑浊的菌液涂抹在含有相应抗生素的固体LB培养基表面，先正置15min，然后倒置于37°C培养箱过夜

11，挑菌：将固体LB表面长出的菌粒挑起，放到含有相应抗生素的液体LB培养基中，37°C摇晃6~10小时，确保菌液变浊，进行菌液测序，保证菌液含有重组载体。提取质粒，此时质粒为重组DNA。该重组载体于-20°C保存。

2013简答题第四题

试述免疫共沉淀的概念，原理和优缺点。

免疫共沉淀(ColP)实验的概念

用抗体将相应特定蛋白沉淀的同时，与该蛋白特异性结合的其他蛋白也会被带着一起沉淀出来的技术。

免疫共沉淀(CoIP)实验的原理

免疫共沉淀(CoIP)技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体(多抗或标签抗体)免疫沉淀X,在体内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。

免疫共沉淀(CoIP)的优缺点

优点

 a，参与相互作用的蛋白处于天然状态

 b，蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，避免了人为的影响，符合体内实际情况，得到 的蛋白可信度高

 c.分离得到的蛋白复合物是天然状态的

 d，在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，快速提供一种或多种基因的调控机制。

缺点

 a，灵敏度不高，检测不到低亲和力和瞬时的蛋白质一蛋白质相互作用

 b，相互作用的蛋白质需要第三者作为中间桥梁

 c.方法存在冒险性，必须在实验前预测目的蛋白，以选择检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果

 d，需要特殊修饰标签的高度特异性抗体。