Waters Q-tof液质联用仪的标准操作规程3.4-3.13（全部更新）
3.5LockSpray Setup
Lockspray setup为测试Lockmass的强度。在做Calibration之前先进行Lockspray setup。IntelliStart 能自动为质量锁Lockmass物质建立离子源参数以保证在采集中得到足够的离子强度。
3.5.1在Masslynx主界面单击MS Tune图标，打开调谐窗口。
3.5.2将挡板切换到LockSpray, 正离子m/z556.2771或负离子m/z554.2615峰强度达到e5 分辨率Resolution>20000,则可以开始LockSpray setup。
3.5.3在MS Console界面，左侧位置选中选择SYNAPT G2-SI /Intellistart，在右侧窗口菜单中勾选Lockspray setup。然后点击Start.
3.5.4从下拉单里选择lockmass的Profile文件（如果没有合适的，可以点击本窗口左下角 的Lockmass Editor按钮进行编辑并创建新的lockmass）保证亮氨酸脑啡肽物质从Lockspray口进样, 点击Next.
Note:LockSpray Profile editor
3.5.5选择 custom 和Display Report复选框, 然后点击 Next.
3.5.6选择 tune page 复选框,点击Next.
3.5.7选择 tune page 复选框,点击Next
3.5.8确保B瓶中有样品，点击Start.
3.5.9当Lockspray source setup完成后，自动出报告同时MS console界面会出现绿勾.
3.6 Create calibration
为保证样品质量数准确测定，软件需要校正质量轴。进样一系列已知质量数参比溶液，软件会比较预期质量数与实测质量数的差别，生成一校正曲线。校正曲线可以用IntelliStart 部分或完全自动生成。IntelliStart可以让操作者自动去核对校正曲线的质量。
3.6.1将挡板打到Sample,将LockSpray
,打开Sample flow
等峰强度达到e5 分辨率Resolution>20000,则可以开始Create Calibration进行校正质量轴
3.6.2在MS Console界面，左侧位置选中选择SYNAPT G2-SI /Intellistart，在右侧窗口菜单中勾选Create Calibration。然后点击Start.
3.6.3在弹出的向导界面点击Next 以进入建立校正曲线。
3.6.4从下拉菜单里选择校正文件，注意橙色三角形表示校正文件已经定义过，但还没有被校正。然后点击Next。
Note: Calibration Profile editor
3.6.5选择Mode, 并勾选Display Report 和 Make the Calibration ProfileActive 复选框点击Next。
3.6.6点击Next
3.6.7选择Tune Page,点击Next。
3.6.8保证甲酸钠Sodium Formate样品在C瓶里，然后点击Start.
3.6.9当Create Calibration完成后，自动出报告同时MS console界面会出现绿勾.
3.7 UPLC的准备
3.7.1准备溶液
A1：水；A2：甲酸水；B1：乙腈或甲醇; 强洗溶液90：10乙腈：水(B2和wash放在强洗溶液中); 弱洗溶液10:90乙腈：水(purge和seal wash放在弱洗溶液中)。
3.7.2灌注流动相Prime solvent
进入MS Console —> Binary Solvent Manager, 在Control —> Prime A/B solvents…下选择要prime的管路。A1、A2、 B1 、B2各4分钟。
3.7.3灌注 seal wash。
在泵长时间未用（几个小时或更长时间）、用过缓冲液流动相以及泵流路中溶液走干的情况下，还需要灌注密封圈（Prime Seal wash）Seal wash溶液一般为10%的有机相，不含任何缓冲盐。选择左栏Binary Solvent Manager ，在右侧窗口中选择菜单Control > Prime seal wash，单击Yes，开始灌注,seal wash的灌注不能设时间，需手动停止：Control > Prime seal wash。
3.7.4灌注自动进样器
（更换了新的强洗弱洗溶液或sample syringe有气泡等情况下）还需灌注sample manager流路（MS Console —>Sample Manager / Control —>Prime syringe）；如更换溶剂，建议做5个cycles。
3.7.4设定流速平衡系统
在Masslynx主界面，单击Inlet Method 图标，打开液相方法编辑窗口。
单击status > ACQUITY Additional Status ，进入液相控制台。单击 A1 或 B1或流速的位置，出现流速、比例设定对话框设定液相流速与比例，单击
。
3.8建立液相方法
3.8.1在Masslynx主界面，单击Inlet Method 图标，打开液相方法编辑窗口编辑泵相关方法，主要有梯度组成、运行时间等。
3.8.2单击Autosampler 图标 打开自动进样器编辑窗口，编辑sample manager及column相关方法，主要有强洗弱洗、柱温及样品室温度(设定方法如下图所示)。样品室温度如样品非特殊要求，建议不要长期设置在10℃以下。
3.8.3选择 File > Save As 保存方法. 并单击Load Method将液相方法配置给仪器，以平衡系统。
3.9建立质谱方法
3.9.1在MassLynx 主界面左侧快捷工具栏, 点击MS Method。
3.9.2选择File>New,建立TOF MS方法参数如下：
Notes:对于SYNAPT G2-Si,低能通道电压设置选择off，仪器使用默认电压6V。低能通道的作用是选择离子，6V默认电压较低，没有起到选择离子的作用，使离子全部通过.
3.9.3点击Lockspray图标，编辑Lockmass，选择合适的Lockspray profile file. 若用Masslynx分析数据选择第一项Acquire Lockspary-Apply correction,若用UNIFI软件分析数据选择第二项Acquire Lockspary-Do not Apply correction,从下拉单里选择LockMass Profile。
3.9.4点击 Method Events，选择Enable 复选框。
3.9.5保存质谱方法。
3.10建立样品序列表
3.10.1在Masslynx主窗口，选择 File > New建立一个空白的样品表Sample list。
3.10.2可点击右键> Add, 增加样品表的行数。
3.10.3在空白的金样列表中输入以下信息：文件名File Name（英文字母，数字和下划线）、样品信息 File Text，双击MS File选择质谱方法（或右键点击browse选择质谱方法），双击Inlet File选择液相方法（或右键点击browse选择液相方法），在Bottle位置中输入样品瓶的 位置，在 Inject Volume中输入进样体积。
Note:选择小瓶位置
Note: File name不能重名，如重名将会覆盖原有的数据。
3.10.4编辑完毕，保存样品表：File > Save As。
3.11运行样品
3.11运行样品：进入 UPLC 界面，等压差小于30psi 才可以开始进样选中要采集的样品，单击Run > Start ,选择Acquire Sample Data only,并单击OK 开始进样并采集。
3.12数据的简单处理
3.12.1在Masslynx软件界面，点击Chromatogram,进入色谱图数据浏览窗口。
3.12.2菜单Display > TIC可以显示其它通道的色谱图，一般情况下最后一个质谱通道为 lockspary通道。
打开BPI色谱图：Display/TIC Chromtagram/把BPI Chromtogram
三个通道的色谱图如下：
3.12.3提取离子流图
菜单Display > Mass可以显示某一质量数的提取离子流色谱图。
3.12.4色谱图的重叠
3.13关机过程
3.13.1自动关机
当运行序列表时可以设置自动关机，自动关机程序如下：选中Edit Shutdown or Start up,在Shutdown界面进行勾选Enable shutdown after batch和Shutdown if queue is in pause。在Auto Control Tasks界面选择 Source Standby 和LC Pump off.
3.13.2日常关机
1. 冲洗质谱管路，冲洗完色谱柱后再进样几针空白乙腈，最后用50%乙腈-水分别冲洗Sample和LockSpray的喷针，将喷针里面的盐置换出来。
2.停止色谱泵：进样结束后需冲洗色谱柱，最后以 100%有机相保存色谱柱， 冲洗完管路后，逐渐把流速降为 0 ml/min。
2.关闭柱温控制器：进入 UPLC 界面，点击 Column Manager 处的温度，输入 off，点击√。
3. 关闭高压
点击此处指示灯由绿色变为黄色，选择Setup下的Instrument standby. 指示灯由黄色变为红色。Note: Source standby：氮气、氩气停，毛细管电压、锥孔电压停，离子源温度降为室温。Instrument standby：在source standby基础上，将加在TOF上的高压电关闭。若仪器只停几个小时可选择Source standby，若仪器停两天以上需选择Instrument standby。
4.待源温降低后再关闭隔离阀，关闭氮气。
3.13.3关机过程
打开MS tune窗口，点击Vacuum/Vent，在弹出的对话框中选择yes。
等待约5分钟。（在这个过程中应该能听到分子泵降速的声音，也可以观察MS tune\View\Vacuum, 六个Turbo speed会逐渐下降，直至六个分子泵的转速均降至5以下，表明真空已经关闭）。
关闭所有软件和电脑。
关闭液相所有模块的电源。
关闭质谱的电源（在质谱背面板右侧位置有四个黑色的可以上下搬动的开关，按照从上向下的顺序依次将这四个开关搬到向下的位置。）
关闭氮气发生器的电源或是液氮罐的开关。
关闭氩气减压阀（如果是HDMS还需要关闭氦气减压阀）。
关机结束
3.14仪器重启过程（仪器出现通讯问题）
关闭所有的软件，并重启电脑，直至显示windows桌面。
在质谱背面板右侧位置有一个银色的可以左右搬动的按钮，将其搬至向右的位置（向左的位置为Auto,向右的位置为Pump Override,在搬动过程中，需要将按钮向外稍微用力才可以上下搬动）
从上向下依次关闭质谱背面板右侧除了Vacuum位置的其他三个黑色的开关。
等待15分钟。
从下向上依次将质谱背面板右侧除了Vacuum位置的其他三个黑色的开关搬到向上的位置。
等待5分钟。（或是进入桌面的 hyperterminal 文件夹，双击其中的的 hypertrm 图标，在 name 处输入 epc 并点击 OK，接着在弹出的窗口中在 Connect using 中选择 com2并点击 ok，在弹出的窗口中将 Bits per second 设为 9600 并点击 ok，在弹出的窗口中直至出现 Done executing startup script 'script.txt'的信息， 表明质谱启动完毕）
双击桌面上的Masslynx V4.1图标，打开Masslynx软件，等待在Masslynx 的主窗口状态栏中部偏右的位置出现“Not Scanning”的信息。
打开MS tune 窗口，单击氩气的控制开关，使氩气关闭。看到MS tune左下角出现“Pump Override Activated”信息后，找到质谱背面板中下部的一个银色按钮，将上方的按钮搬到向上的位置。这时“Pump Override Activated”信息将会消失。
点击MS tune窗口右下角的operate按钮，看到右下角红色方块变成绿色后完成。
重启完毕。
3.15亮氨酸脑啡肽溶液和甲酸钠溶液的配制过程
1 ng/µL leucine enkephalin
1. Using a 5-mL pipette, add 7.5 mL of water to the contents of a 3 ±0.15 mg bottle of leucine enkephalin.
2. Recap, shake well, and sonicate for 5 minutes.
3. Label as "400 ng/µL leucine enkephalin in water" and store in the freezer (expires in 3 months).
4. Using a 200-µL pipette, transfer 50 µL of the 400 ng/µL leucine enkephalin in water to a 20-mL volumetric flask.
5. Make up to 20 mL with 50:50 acetonitrile:water + 0.1% formic acid and sonicate for5 minutes.
6. Label as "1 ng/µL leucine enkephalin in 50:50 acetonitrile:water + 0.1% formic acid"and store in the freezer (expires in 1 month).
7. For Fluidics systems, transfer from the 20-mL volumetric flask to a 30-mL fluidics container and label as "1 ng/µL leucine enkephalin in 50:50 acetonitrile:water + 0.1% formic acid" and store in the freezer (expires in 1 month).
50:50 acetonitrile:water + 0.1% formic acid的配制过程
用100ml的量筒转移25ml LCMS级乙腈到100ml的容量瓶中。
用100ml的量筒转移25ml去离子水到100ml的容量瓶中。
用200ul的移液枪加50ul的甲酸到100ml的容量瓶中。
超声10分钟，标签为50:50 acetonitrile:water + 0.1% formic acid
5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water
1. Using a 1000-µL pipette, transfer 1000 µL of 0.1 M sodium hydroxide solution to a 20-mL volumetric flask.
2. Using a 1000-µL pipette, transfer 900 µL of deionized or LCMS-grade water to the 20-mL volumetric flask.
3. Using a 200-µL pipette, add 100 µL formic acid to the 20-mL volumetric flask.
4. Make up to 20 mL with 90:10 2-propanol:water and sonicate for 5 minutes.
5. Label as "5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water" and store in the refrigerator (expires in 1 week).
6. For Fluidics systems, transfer from the 20-mL volumetric flask to a 30-mL fluidics container and label as "5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water" and store in the refrigerator (expires in 1 week).
0.5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water
1. Using a 1000-µL pipette, add 2000 µL of 5 mM sodium formate solution to a 20-mL volumetric flask.
2. Make up to 20 mL with 90:10 2-propanol:water and sonicate for 5 minutes.
3. Label as "0.5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water" and store in the refrigerator (expires in 1 week).
4. For Fluidics systems, transfer from the 20-mL volumetric flask to a 30-mL fluidics container and label as "0.5 mM sodium formate solution in 90:10 2-propanol:water" and store in the refrigerator (expires in 1 week).
Notes:
1.试剂的级别：2-propanol异丙醇（HPLC级）、Acetonitrile乙腈（LC-MS级）、Methanol甲醇（LC-MS级）、deionized or LCMS-grade water。
2.配制过程需用10/100ml量筒、20/100ml的容量瓶、200/1000ul移液枪
3.所有的玻璃器皿需洁净，用甲醇冲洗，使用前干燥（不能用任何洗涤剂清洗）
4.配制0.1 M sodium hydroxide in water需提前烧开水，除去水中的CO2.
4注意事项
4.1流动相和清洗液
1.总是使用清洁的玻璃器皿(瓶子, 量筒或溶剂过滤装置),并在用前冲洗干净；尽量保持一组溶剂瓶和玻璃器皿专用于ACQUITY UPLC系统。决不要用其他实验室(例如微生物实验室等)的玻璃器具来冲洗UPLC的玻璃容器需在试剂瓶上做好标签如日期、姓名、组成等
2.A1：水 A2：甲酸水 B1：乙腈或甲醇 B2和wash放在强洗溶液中（乙腈：水9:1） purge和seal wash放在弱洗溶液中（水：乙腈9:1）。质谱部分的清洗液为50:50甲醇：水。
3.超纯水和缓冲液一般使用不得超过二天。低有机相溶剂（10%以下的有机相，避免长菌，影响分析及仪器性能）不要超过一周。有机溶剂也不应一次性加的体积过多，有机相长期不用时也需要重新配置，避免长时间不换变质。
4.不能将新配的流动相直接倒入没有充分清洗或还存有旧流动相的储液瓶内。每24-48小时即应仔细清洗流动相瓶并配制新鲜流动相。
5.有机相要使用原装进口的质谱纯溶剂，常用的有 MERCK，FISHER 等品牌的质谱级甲醇、乙腈有机溶剂，水相一般为屈臣氏纯净水。
6.超纯水和缓冲液一般使用不得超过二天。
7.缓冲盐一定是可挥发的，一般浓度不超过10mM。常用的缓冲盐有：甲酸，乙酸，甲酸铵，乙酸铵，氨水等。使用所能得到的最高等级（至少为色谱级）的缓冲盐。缓冲盐会在离子源部分结晶、沉积会把锥孔烧黑。
8. 仔细检查所有流动相和清洗液， 确定瓶内无沉积物和絮状物后方可使用。
9.样品保存：甲酸LC-MS级。甲酸需置于冰箱-4℃中保存。亮氨酸脑啡肽溶液：母液需置于冰箱-20℃中保存（防止亮氨酸脑啡肽分解），用时解冻。
10.样品瓶是UPLC分析中易被忽视的地方，使用不当往往会使SM出现进样针故障。推荐使用有预开口设计的瓶盖。
4.2液质常用的流动相和添加剂
LCMS常用的流动相： 水 乙腈 甲醇 异丙醇
LCMS常用的添加剂：乙酸 甲酸 三氟乙酸（正离子） 氨水 氢氧化铵 甲酸铵* 乙酸铵* 碳酸氢铵 * 盐浓度应限制在10 mM 以下
LC/MS流动相中不适宜的添加剂
非挥发性的盐： (磷酸盐, 硼酸盐, 柠檬酸盐, 碳酸盐等等)，会在离子源部分结晶、沉积
无机酸：具腐蚀性（硫酸、高氯酸、磷酸、盐酸、磺酸等）
三氟醋酸 (TFA)：浓度 0.01% 时会抑制电喷雾的正离子会大大抑制电喷雾的负离子。
碱：季胺 强碱 三乙胺 (TEA)：对弱碱性化合物而言，将会抑制电喷雾的正离子且极容易电离得到非常强的 m/z 102 分子离子（MH+）
四氢呋喃（THF）非常易燃
表面活性剂 /洗涤剂 ：会抑制电喷雾电离.
4.4样品预处理方法的选择
样品处理的好坏直接关系到整个LC-MS分析的成败，必须要有成熟规范的样品制备方法。样品预处理各步不能随意省略，如萃取、分离、去盐等。某些化合物必须化学衍生化以适应LC-MS 要求，如磷酸酯水解。若MS信号实在太低，考虑更换样品处理方法。此外浓度非常低的样品不能保存太长时间，容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，标准品工作液现配现用。
在生物样品预处理中经常使用到的方法主要有以下三种-沉淀蛋白法、液液提取法和固相萃取法（SPE），而这三种方法的选择，主要取决于化合物的特性。分析极性比较大的化合物，优先考虑使用沉淀蛋白法，这种方法操作简单，省时省力；缺点是生物基质中内源性物质去除的不彻底，基质效应较大，使得方法灵敏度不高。分析极性较小的化合物，我们可以选择液液萃取法，这种方法根据相似相溶的原则进行分离提取，优点在于处理完的样品较干净，内源性物质去除彻底；缺点在于消耗有机试剂的量很大，对操作人员、环境的污染也大。固相萃取法采用固相萃取小柱作为分离媒介，小柱添加了不同填料的固定相，如以键合硅胶为基质的如C18、NH2、 COOH、PSA、SAX等，是硅胶的表面活性大为降低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高纯度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性吸附达到分离的目的。因此，固相萃取法适用于各种极性的化合物，样品处理过程中使用的设备简单，柱子活化便捷，基质效应低；缺点是价格昂贵。如今出现了96孔板的固相萃取小柱，可以批量处理样品，耗材少，耗时短，大大提高了工作效率。
4.5用PEEK管时注意溶剂的使用，HNO3，H2SO4会腐蚀PEEK管。DMSO 、THF、CH2Cl2会溶胀PEEK管。
4.6样品贮存在塑料离心管中，其中的添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡 时间较长时，会产生干扰物信号
4.7工作站计算机不要安装与仪器操作无关的软件，要经常清理计算机磁盘碎片， 定期查杀病毒，定期备份实验数据。
