测序中可能遇到的问题及解决方案

问题说明：正向测序失败，反向成功，但是比对后发现存在后面目的片段不全，以及部分位点的突变。峰图也存在突变位点信号不足的问题。

解决方案1：首先打电话和技术沟通

给出了专业的回答：结果可以与您预期序列比对上的话，是代表插入成功的~反向成功的结果整体信号也非常弱，正向的失败，从胶图来看很有可能是模板浓度较低导致的，建议您可以送菌液测序。

解决方案2：咨询实验室同门的话，可以知道，峰图和测序结果前后100bp结果是不准确的，需要进行载体通用引物的测序，不建议使用质粒上的外源插入目的片段的引物测序。

因此我和技术沟通后进行了测序引物的更换，加测了通用引物的测序。等待结果中，如果后续结果不好的话，还需要进行菌液送测。

解决方案3：看下知乎大神的解决方案

1.样品测序无信号

可能是引物结合位点不存在或被破坏；建议更换引物测序或重新提供样品测序。

2.样品测序信号差

可能是引物或模板的质量不高或是引物和模板的匹配性不好引起的，也可能是样品浓度偏低；建议提供高质量样品测序。

3.样品测序衰减

可能是由于特殊结构如Poly结构、重复序列、回文结构、发卡结构、GCrich、AT富集等导致的测序衰减，由于是样品本身结构问题无法优化建议反向测序进行拼接以得到完整序列，还有一种衰减的情况就是在一段正常峰型后逐渐衰减，可能是模板量反应量不足导致，建议制备高浓度模板测序。

4.样品测序套峰

套峰细分的话有如下几种情形:

①全双峰：多引物结合位点（针对菌液、质粒样品），非特异性扩增（针对PCR产物）；

②前双峰：多引物结合位点，其中一套模板测序中断（针对菌液、质粒样品），多引物结合位点（PCR未纯化样品），引物二聚体或小片段干扰（针对PCR已纯化样品）；

③中间双峰：非单克隆（针对质粒、菌液样品），碱基缺失或等位基因双模板（针对PCR未纯化样品）；

④后双峰：非单克隆（针对菌液、质粒样品），碱基缺失（针对PCR样品）；

针对二聚体及小片段干扰的情况建议电泳切胶回收纯化；针对多引物结合位点的情况建议更换引物测序或反方向测通样品；针对碱基缺失建议克隆测序；针对非单克隆建议在克隆无误的前提下重新挑取单克隆测序；针对非特异性扩增建议优化反应条件重新制备样品测序；针对等位基因双模板建议克隆测序。

5.样品测序中断

可能样品存在特殊高级结构，导致dNTP和ddNTP在某一碱基位点后无法与模板结合，测序酶无法继续延伸，建议使用反向引物进行测序经拼接后可以得到完整序列；或酶切后亚克隆测序。6.样品测序移码

测序从开端发生移码可能是引物发生降解，建议重新提供引物；测序局部出现移码，可能样品存在特殊高级结构，建议反向测通。

7.样品测序底峰干扰

可能测序引物不纯，建议将引物进行PAGE胶纯化后在进行测序或重新提供引物测序；可能测序样品不纯，混有正、反向引物，建议重新制备样品测序。