结构生物化学【2】

第五章    核苷酸

第一节  核苷酸的结构与组成

碱基

1.结构：核苷与无机磷酸由β-N-糖苷键连接而成

2.常见碱基：胞嘧啶，尿嘧啶，胸腺嘧啶（5-甲基尿嘧啶）；腺嘌呤，鸟嘌呤

3.修饰碱基：多为碱基的修饰产物或代谢产物。如5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、N6-甲基A、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、二氢尿嘧啶

4.碱基的性质

（1）紫外吸收性质：碱基杂环上的共轭双键对于紫外线有较强的吸收

（2）水溶性差（疏水性质）

（3）解离：在中性条件下碱基主要以内酰胺的形式存在

（4）含有多个氢键供体和氢键受体

（5）互变异构：嘧啶环和嘌呤环环上的取代碱基的富电子性质使它们有互变异构

               酮式-烯醇式；氨基式-亚氨基式。如果在碱性环境下，平衡向烯醇式或亚氨基式移动

               现有碱基配对基础建立在全为酮式和氨基式

核苷

1.结构：戊糖和碱基由β-N-糖苷键相连

2.构象：碱基在糖苷上的旋转受到空间位阻的限制

       顺势和反式（碱基是否与戊糖在同一方向上）

       除了Z-DNA，都是以反向的形式构成

3.常见核苷

4.修饰核苷：修饰碱基和戊糖组成的核苷；核糖环被修饰的核苷以及少数不是以N-糖苷键相连的核苷

5.性质：高亲水性（核糖基起作用）

核苷酸

1.结构：戊糖羟基发生磷酸化反应生成

2，核苷单核苷酸

单核苷酸可以通过成酐反应分别形成核苷二磷酸、核苷三磷酸

3.环核苷酸

某些核苷一磷酸在环化酶的催化下，形成环核苷酸，在细胞中主要作为第二信使

cAMP既可以在细菌体内作为一种第二信使，激活多种与糖类分解代谢有关的相关基因表达，也可以在高等生物体内与cGMP一样，作为激素的第              二信使

c-dicGMP在多种细菌中作为第二信使，参与生物膜的形成和致病因子的形成

4.构象：具有一定的柔性

5.理化性质

碱基：紫外吸收、互变异构；核糖：易溶于水、旋旋光性；共同决定：两性解离、等电点；N-糖苷键：在酸性环境中发生脱碱基反应

第二节  核苷酸的功能

1.作为核酸形成的前体

2.充当能量货币：ATP（能量货币）；GTP（蛋白质合成）；CTP（脂质合成）；UTP（糖类合成）

3.参与信号转导cAMP、cGMP第二信使；GTP、GDP激活G蛋白

4.作为其他物质的前体：ADP为辅酶I和辅酶Ⅱ的组分；鸟苷酸作为第一类内含子核酶的辅酶

5.参与物质合成

6.作为一些酶的别构效应物

7.调节基因的表达

 

 

第六章   核苷酸的结构和功能

第一节  核酸的分类

分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，二者区别如下：

1.RNA分子中的戊糖是核糖，DNA分子中的戊糖是脱氧核糖

DNA因为是脱氧核糖，所以缺乏反应性的亲和性集团——2‘-OH,降低了磷酸二脂键自发水解的速率，提高了DNA的稳定性

RNA因为有2‘-OH，亲核性较大，非常不稳定，常利用其亲核进攻性，催化一些生化反应

但tRNA和rRNA非常稳定，是因为它们的羟基受到了甲基化修饰，大大降低了2‘-O原子的反应性

2.RNA的第四个碱基为U，DNA第四个碱基为T（U去甲基化）

C可自发的脱氨基变成U

用T代替U是为了有效的检测c-u这种突变

3.RNA通常是单链，DNA通常是双链

RNA的类别

第二节  核酸的一级结构

核酸的多聚核苷酸链上所有核苷酸或碱基的排列顺序

多聚阴离子复合物

第三节  核酸的二级结构

DNA的结构

1.DNA的二级结构有B性，除此之外还有A、Z型

2.稳定双螺旋结构的因素

（1）氢键  （2）碱基堆积力（疏水作用力、范德华力）  （3）磷酸核糖骨架上的负电荷中和

3.DNA非标准的二级结构

（1）弯曲：含有成串的A序列或蛋白质作用（TATA盒结合蛋白可导致DNA启动子区域弯曲，大肠杆菌cAMP受体结合蛋白可导致乳糖操纵子形成弯曲）；同时有时也可以做DNA修复系统识别损伤的信号

（2）十字形（存在于复制起始区域和转录调控区域）：充当某种控制DNA复制和基因转录的开关

（3）三螺旋：有顺式（平行于嘌呤链）和反式的结构（反平行于嘌呤链）

             形成三股螺旋可以影响到DNA的复制、重组和转录，还可以阻止特定蛋白质与DNA的结合，从而对碱基的表达起调控作用

               三股螺旋的形成需要互补的全嘌呤和全嘧啶碱基，还需要呈现镜像重复，第三条链上的C需要质子化才可以与G配对。超螺旋的形成有利于三股螺旋的形成

（4）碱基翻转：某个碱基出现在双螺旋之外

              催化碱基修饰的酶需要碱基通过翻转才可以对它进行化学修饰，碱基切除修复也是

（5）滑移错配DNA：重新形成双螺旋的时候，错配，形成两个环，会导致移框突变

（6）四链DNA

RNA的结构

主要形成α螺旋

发夹结构：包括两个部分（标准碱基互补序列和双螺旋两股互补序列之间未配对的碱基序列组成的环）

在RNA中常有GU碱基对，有利于形成链内双螺旋

（1）tRNA的二级结构

有不少是修饰的碱基（黄嘌呤、硫脲嘧啶、假尿嘧啶）

构成tRNA的二级结构的要素有：环、茎、臂。按照从5‘-3‘的顺序，4个环依次是D环、反密码子环、可变环和TΦC环；4个茎依次是受体茎、D茎、反密码子茎和TΦC茎；臂有D臂、反密码子臂、TΦC臂和氨基酸臂

受体茎是紧靠着氨基酸臂，与tRNA形成氨酰tRNA的地方。且3‘端最后的三个核苷酸总是CCA，与3’端最后一个核苷酸一起，并不参与受体茎，而是构成氨基酸臂。

D环上有二氢尿嘧啶，反密码子环有反密码子，紧靠反密码子5‘端的氨基酸总是U紧靠3’端的氨基酸总是嘌呤核苷酸，且总是被烷基化

在反密码子环和TΦC环之间，通常还会有一个可变环或附加环，TΦC环上的Φ指的是假尿苷，核糖体和转运RNA之间的结合有赖于对TΦC的识别

（2）rRNA的二级结构

原核生物：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA

真核生物：5SrRNA、5.85SrRNA、18SrRNA和28SrRNA

其中5SrRNA在真核生物与原核生物中都有

rRNA在链内有大量的互补序列，所以它高度折叠

16SrRNA在进化中只要保证它的二级结构基本不变就行了，不用在意一级结构的变化

（3）mRNA的二级结构

（4）DNA-RNA杂交存在形成的双链：A型双链（DNA复制、转录和逆转录）

第四节  核酸的三级结构

1.DNA的三级结构

主要以两种形式存在：松弛型和超螺旋

在松弛型下，DNA以B型双螺旋存在，能量状态最低

DNA的超螺旋包括正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋是左手螺旋，由DNA双螺旋过度缠绕形成的；负超螺旋是右手螺旋，由DNA双螺旋缠绕不足引起的的（易于解链，有利于复制、转录和重组，）

某些和碱基差不多的多环芳香族分子（如溴乙锭和吖啶橙）可以插到DNA双螺旋两个相邻的碱基对之间，促进产生正超螺旋。这些分子都是强烈的致癌物质，容易诱发DNA在复制时发生突变

2.RNA的三级结构

RNA分子伴侣（非特异性结合蛋白NADP）有利于帮助RNA形成正确的构象，破坏错误折叠的RNA分子内部的化学键，形成RNA蛋白体复合物，RNA最终形成正确的构想

驱动和稳定RNA三级结构的常常是金属离子和碱性蛋白

常见结构

（1）假节结构（常参与形成多种核酶和自我剪切的内含子；诱导病毒在翻译过程中发生核糖体移框；对于端聚酶来说发挥活性有重要作用，端聚酶的RNA作为端粒DNA的模板，高度保守的假节是活性发生所必须

（2）吻式发夹：两个独立的发夹结构通过环之间的碱基配对形成的共轴螺旋。艾滋病病毒的基因组RNA分子上有这个结构

第五节  核酸和蛋白质形成的复合物

1.DNA与蛋白质形成的结构

（1）真核生物的核小体

组蛋白：各两组【H4、H3】、【H2A、H2B】聚集形成八聚体，H1游离在外

保守性最高的是H4，其次是H3，再其次是H2A、H2B。变化最大的是H1（物种特异性）

某些组织中无H1，被其他类型的代替，如鸟类的H5

DNA序列在核小体的选位中十分重要，多分布于GC区域

在人类细胞中，包裹在核小体外序列的C甲基化程度高于连线DNA

(2)古菌的核小体

HMFA和HMFB    短于真核生物

缺乏尾，故古真菌的核小体无法进行各式各样的化学修饰

（3）细菌的拟核

细菌具有一些小的碱性蛋白（HU、FIS）与核结合，形成拟核

2.RNA与蛋白质形成的复合物

 

 

第七章    核酸的理化性质及研究方法

第一节  核酸的理化性质

1.紫外吸收：和碱基有关

2.酸碱解离：同核苷酸

3.粘度：结构细长并有一定刚性的大分子粘度更好

4.沉淀：用乙酸钠来降低溶液极性，用无水乙醇沉淀DNA，用异丙醇来沉淀RNA

5.变性：热变形（增加分子内能，破坏氢键和碱基堆积力）

           碱变性（易发生互变异构）

     变性引起的改变：紫外吸收增加（碱基被解放）（增色效应）

                     增加DNA的浮力密度（互补碱基形成更加致密的结构）

                     降低DNA分子的粘度

     Tm值:DNA双螺旋有一半发生变性热或有一半氢键收到破坏时的相应的温度

6.复性：减色效应

7.杂交：利用核酸分子的变性和复性的性质，对来源不同的核酸片段按照碱基配对规则形成异源杂链，进而对特定对象进行定量、定性分析的技术

     Southern 印记 （RNA印记）        Northern 印记（DNA印记）

8.核酸的水解

（1）酸水解：敏感性：糖苷键>磷酸酯键>；嘌呤糖苷键>嘧啶糖苷键

（2）碱水解：RNA特别是mRNA内磷酸二脂键对碱异常敏感。DNA对碱不敏感

（3）酶促水解

第二节  核酸研究的技术和方法

1.核酸的分离和纯化

（1）核酸的抽取

核酸在细胞核中通常以核蛋白的形式存在，可以用不同浓度的盐溶液进行分离

用酚/氯仿抽取中，核酸溶解在上层水相（DNA位于上层【浮力密度小】，变性之后会略微下

沉【浮力密度变大】【RNA在溶液中的状态同变形后的DNA】），蛋白质处于两相之间的界面

（2）电泳

琼脂糖凝胶电泳，可以使用溴乙锭染色进行鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳，用放射性自显影或银染等方法进行检测

（3）离心

（4）层析：阴离子交换层析制备核酸；羟基磷石灰分离单链DNA；双链DNA;寡聚dt亲和层析分离带有多聚腺苷酸尾的整合生物mRNA

3.核酸一级结构的测定

（1）DNA一级结构测定

  1）第一代DNA测序

【1】双脱氧法测序（末端终止法）：通常使用一种经过基因工程改造过的噬菌体DNA聚合酶来催化测序反应，引物是人工合成的寡聚脱氧核苷酸（已被同位素标记）。每组反应使用相同的模板、相同的引物以及相同的dNTP，并且在魅族反应中加入一种适量的2‘，3‘-双脱氧核苷酸（ddNTP）使其随机的掺入DNA链中。一旦ddNTP进入DNA链中，将导致DNA链合成的末端终止，产生4组具有特定长度、不同长短的DNA片段，其中每一组内DNA片段以相同的双脱氧核苷酸结尾，再通过放射自显影技术自下向上读出DNA的核苷酸序列（小片段在下，大片段在上）

【2】碱基特异性化学断裂法

  2）第二代测序

【1】454Life science焦磷酸测序法

将待测的DNA切成几百个碱基长度的单链片段，每一个片段被固定在一个小珠子上，随后

使用PCR进行扩增，使每一个珠子上带有许多相同的DNA，之后加入酶，形成级联化学发

光反应，将释放出来的焦磷酸基团转化为光信号

以将待测的单链DNA作为模板，与特异性的测序引物结合（腺苷-5‘-硫酸磷酸【APS】、荧

光素），再向其中加入4种酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶）。再向

反应体系中加入1种dNTP，如果正好可以和下一个碱基配对，就会在DNA聚合酶的催化

下被添加到测序引物的3’端，同时释放出1分子的焦磷酸（注意：DNA聚合酶对dATPαS的

催化效率高，且dATPαS不作为荧光素酶的底物，故用dATPαS代替dATP.）。在ATP硫酸

化酶的作用下，生成的焦磷酸可以和APS结合生成ATP，在荧光素酶的催化下发光。经过

电荷偶联系统，可以得到一个检测峰，峰值高低和相匹配的碱基成正比。反应体系中剩余的

dNTP和残留的少量的ATP在双磷酸酶的催化下发生降解。再加入另外几种dNTP，重复操

作

【2】Illumina/Solexa测序

【3】SOLID测序

3）第三代DNA测序

对单分子DNA测序 反应在纳米容器中进行（降低背景光，使每个核苷酸发出的单道光可以被检测到）；荧光标签不一定标在参入的脱氧核苷酸上，可能标在释放出来的焦磷酸基团上。

  4）第四代DNA测序

利用离子流测序（对于DNA复制合成互补的DNA链时，释放质子，通过对质子的监控来实时判读碱基）（后光测序），测定的是伴随一个新脱氧核苷酸的参入释放出来的质子

  5）单细胞基因组测序

分离出单个细胞，并进行全基因组的扩增（多重取代扩增），然后构建测序文库，最后使用新一代测序技术进行分析

（2）RNA一级结构的测定

质谱分析或利用反转录酶将待测的RNA反转录成cDNA