Nature Biotechnology:合成生物学与抗肿瘤纳米研究的完美结合

哥伦比亚大学TalDanino、Kam W. Leong等人在Nature Biotechnology上发表了题为“A programmable encapsulation system improves delivery of therapeutic bacteria in mice”的论文，提出了一种可调节的微生物表面工程策略，使用合成基因回路来动态控制细菌与其周围环境的相互作用。

本研究内容基于肿瘤细菌疗法，小编先来解释肿瘤细菌疗法的机制。肿瘤细菌疗法：进入肿瘤组织的细菌，无论是活菌还是灭活细菌，都可诱发机体的固有免疫和适应性免疫，进而改变肿瘤免疫微环境。机体的天然免疫细胞可识别细菌上的病原体相关分子模式，吞噬并摧毁细菌，分泌细胞因子，同时触发更为特异性的适应性免疫。此外，细菌可利用其大量不同的理化性质（如脂肪、蛋白等天然成分），借助树突状细胞的交叉递呈作用，诱导CD4+和CD8+T细胞相结合杀伤肿瘤。这里又提到了新名词，交叉递呈作用。根据抗原的来源及性质，DCs主要通过MHCⅠ类分子提呈途径、MHCⅡ类分子提呈途径和交叉提呈途径对抗原进行加工和提呈。MHCⅠ类分子提呈途径是指内源性的抗原被降解成抗原肽并装载于MHCⅠ类分子，提呈给CD8+T细胞的过程；MHCⅡ类分子提呈途径是外源性抗原通过吞噬、胞饮、受体介导等内吞作用摄取抗原，装载到MHCⅡ类分子，提呈给CD4+T细胞的过程；交叉提呈途径则是DCs对外源性抗原的一种抗原提呈方式，即外源性抗原经DCs作用后与MHCⅠ类分子形成复合体，提呈给CD8+T细胞的过程。再介绍内源和外源性抗原的分类。内源性抗原是指在抗原提呈细胞内新合成，存在于胞质内的蛋白质抗原。外源性抗原是指抗原提呈细胞从胞外摄取，存在于细胞囊膜系统内的蛋白质抗原。例如，细菌蛋白等外来抗原通过胞吞、胞饮和受体介导内吞作用进入抗原提呈细胞内。微生物可以被设计为一种可以感知和反应环境的智能生物药物，它们可以定植在体内，实现局部治疗。然而，活细菌的宿主毒性限制了可耐受剂量和疗效。与传统药物载体不同的是，细菌功能的独特性在于持续增殖、转移、在肿瘤组织中递送药物，因此，在药物代谢动力学层面上必须对其进行稳定和时间控制。一种规避活细菌治疗的免疫原性和毒性的方法是将抗原的基因敲除，如脂多糖（LPS）。但是这种方法会导致永久的细菌衰减，减少定殖量。表面修饰已广泛应用于给药载体，因此，之前的研究提出了为微生物制造合成的表面涂层，如海藻酸盐、壳聚糖、聚多巴胺、脂类、纳米颗粒等。这些一次性的细菌静态修饰不允许原位调节，并可能导致不受控制的生长、脱靶毒性或细胞功能受损，从而导致疗效降低。因此，在不影响安全性的情况下提高细菌治疗效果是癌症活体微生物治疗临床转化的核心挑战。本文利用基因合成线路设计了一种可调节的微生物表面改造策略，动态控制细菌与周围环境的相互作用。荚膜多糖（CAP）是一种天然的包裹在细胞外膜上的生物聚合物，能够保护微生物免受环境的干扰。在人体中，CAP可以保护细菌免受各种免疫因子的干扰，促进其存活和定殖。受此启发，研究人员构建了一个CAP表达系统，通过外部诱导剂调节细菌表面，从而控制细菌与抗菌素、噬菌体、酸度、宿主免疫之间的相互作用。本文基于对荚膜生物合成途径的小分子RNA筛选，构建了一种调节细菌封装的可诱导合成基因片段。这些细菌能够暂时逃避免疫攻击，而随后的封装损失可使其在体内被有效清除。动态给药策略使细菌的最大耐受剂量增加了10倍。原位封装增加了小鼠肿瘤中微生物易位的比例，使其对远端肿瘤同样有效。

可用于治疗的细菌较多，经免疫原性和活性比较，E.coli Nissle 1917（EcN），具有良好的临床表现，在人体全身血管中活性较高，注射后在小鼠体内引起的免疫反应最小。EcN的k5-CAP可以改变与宿主免疫系统的相互作用，因此被选来从基因上修饰其生物合成途径。k5-CAP，也被称为肝聚糖，是由交替的β-D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N乙酰αD葡萄糖胺（GlcNA）组成的聚合物链，再连接到3-脱氧-D-甘露-oct-2-葡萄糖酸（Kdo）连接体

图1  用于控制细菌封装和体内传递的CAP系统

图2  敲除CAP生物合成中的关键基因

本部分小结：

1.     基于上述研究，选择kfiC，一种编码GlcNAc糖转移酶的基因，这种糖转移酶的丢失会导致CAP无法产生。

2.     kifC越少，血液敏感性越强，因此可以通过控制基因表达来选择性调节免疫保护的水平。

3.     验证细菌表面CAP是否存在，采用噬菌体斑块试验（Phageplaque formation assay）；纯化和检测细菌杂多糖，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAEG）；观察形态学变化，扫描电镜（TEM）。

4.     研究了CAP保护细胞免受多种抗菌因子影响的能力，EcNΔkfiC对抗生素的细胞保护作用显著降低。

综上，CAP的丢失改变了细胞表面结构和对抗菌因子的保护作用。

图3  iCAP系统的设计和表征

本部分小结：

1.      转化了低拷贝数质粒的EcNΔkfiC对ΦK1-5具有完全的免疫力。

2.      随着IPTG水平的升高，EcN-iCAP系统的CAP产量增加EcN-iCAP的活力降低，细菌膜的平均膜厚度从44增加到81nm，证实了该系统的可调能力。

3.      评估了iCAP系统的生产和回收，加入IPTG后，观察到CAP的产量升高，在6小时后达到接近最大水平；去除IPTG导致CAP逐渐下降，6小时后完全抑制；通过与ΦK1-5共孵育测试iCAP的动态：未诱导的EcNiCAP生长，但在共孵育开始时，用IPTG诱导导致3.5小时的快速裂解，SDS-PAGE观察到的CAP产生延迟。

图4  CAP系统与宿主免疫因子的可调性相互作用

本部分小结：

1.     经IPTG诱导后的EcN-iCAP存活率高于未经诱导组，增加IPTG水平可以使细菌存活率至少提高105倍。

2.     在不同IPTG浓度下短暂激活EcN-iCAP后观察细菌随时间的存活情况。野生型EcN存活时间超过6小时，EcN-ΔkfiC在前0.5小时内迅速下降到检测下限。

3.     共培养EcN-iCAP与BMDMs，观察到提前进行iCAP激活组中巨噬细胞内细菌的摄取减少。

4.     与未诱导的对照相比，IPTG诱导的细菌的吞噬作用减少10倍。

5.     CAP的缺失提高了许多炎症细胞因子的水平，而加入IPTG诱导后炎症细胞因子水平恢复。

图5  瞬时CAP激活提高了体内细菌的全身递送和疗效

本部分小结：

1.     EcN小鼠体内的急性炎症细胞因子水平低于EcNΔkfiC组。

2.     EcN-iCAP比EcNΔkfiC诱导的炎症反应少，说明ECN-iCAP在体内成功封装。

3.     长期追踪发现，中性粒细胞数量会增加，即持续存在的CAP可能导致全身炎症反应和毒性。

4.     瞬时诱导的EcN-iCAP的可耐受剂量比EcN和EcNΔkfiC高10倍。

5.     腹腔注射细菌致脓毒症以模拟严重毒性，发现EcN-iCAP的安全性明显高于其他两组。

6.     研究注射后体内分布情况，在外周器官中发现的EcN和EcN-iCAP比EcNΔkfiC减少了约10倍。

7.     验证抗肿瘤效果，EcN-iCAP在肿瘤中的信号明显高于其他所有组，单次以可耐受剂量给药的EcN-iCAP组可显著抑制肿瘤生长，且小鼠体重无明显变化。

8.     注射2天后分离瘤内细菌，在含有ΦK1-5的LB培养基中培养，EcN-iCAP、可以生长，说明肿瘤细胞中无CAP。

综上所述，iCAP系统能够增加可耐受的细菌剂量并提高治疗效果。

图6  原位激活CAP使Ec易位到远端肿瘤进行治疗

本部分结论：

如图6所述，与未诱导的细菌相比，细菌向远端肿瘤的易位明显增加。

剂量毒性一直是临床转化上的一个难点，近来的一些研究多关注于基因减毒工程菌，但在细菌传递策略上仍有待改进。本研究展示了一种合成生物学方法，可用于在体内治疗递送阶段动态和可调地调节细菌表面。本研究中发现的其他基因也可用于控制不同的敏感性或独立地改变细菌对各种环境因素的敏感性。同时，这种方法可以应用于其他大肠杆菌菌株