实验操作喂饭教学—细胞传代

 细胞传代

①细胞密度达到细胞瓶底面积的90%，且生长状况良好，未被污染时，应及时对细胞进行传代。在超净工作台内预先放入完全培养基、0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲溶液等，紫外照射消毒30 min。弃去培养基，向细胞瓶的侧壁轻轻打入2 ml磷酸盐缓冲溶液，注意不要直接冲击生长贴壁细胞的细胞瓶底部，轻柔晃动细胞瓶，洗涤细胞表面，弃去培养基，该操作予以重复2次。

②吸净残留的磷酸盐缓冲溶液，向细胞瓶的侧壁或顶部轻轻打入1 ml的0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液，注意不要直接冲击生长贴壁细胞的细胞瓶底部，轻柔晃动细胞瓶，确保0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液与细胞充分接触，放入37℃细胞培养箱内消化，根据细胞的种类及生长状况确定消化时间，在显微镜下观察，确保细胞完全消化。

③弃去0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液，轻拍细胞瓶的侧壁和顶部，使细胞更容易脱落，注意不要直接冲击生长贴壁细胞的细胞瓶底部。向细胞瓶内加入3 ml 含10% FBS的完全培养基，此时可以直接将培养基注入细胞瓶底部，使培养基与胰酶充分接触，便于中和胰蛋白酶消化液。若胰蛋白酶消化液中脱落细胞较多，也可直接向细胞瓶内加入3 ml的含10% FBS的完全培养基终止消化。在灯光下一边观察细胞是否脱落，一边吹打细胞瓶的各个角落，注意动作不可过于暴力，将瓶底部的细胞吹打冲洗下来，以免对细胞造成损害，将细胞悬液移入10 ml离心管。

④室温800 rpm/min离心5 min，弃去残留胰蛋白酶消化液的上清液，向离心管内加入3 ml的含10% FBS的完全培养基，目的是使离心后聚集的成团细胞再次成为单个细胞，使完全培养基和离心管底部的细胞沉淀充分混匀，重悬至细胞分布均匀且为单个细胞。根据实验需要将细胞悬液转移至新的培养瓶中，根据实验计划和细胞种类确定传代比例，补足细胞瓶内培养基，标注传代时间、细胞名称、细胞代数、细胞瓶编号、实验人员姓名等基本信息，放入37℃细胞培养箱进行培养。次日显微镜下观察细胞有无贴壁，生长状况是否良好。

本人保留一切权利，以上实验步骤仅供参考。