生物制药综合实验（重组质粒模块）实验八 重组表达宿主菌的诱导表达

实验目的：

1、了解诱导外源基因表达的基本原理；

2、学习和掌握诱导外源基因表达的常用方法；

3、诱导外源基因表达，为后续SDS-PAGE和蛋白纯化实验做准备。

实验原理：

基因工程的最终目的是在一个合适的系统内，使外源基因高效表达，从而产生有重要价值的蛋白质产品。外源基因在宿主菌中的表达就是使克隆在表达载体上的外源基因在宿主菌中以发酵的方式快速、高效的合成基因产物。

通常表达载体不应使外源基因始终处于转录和翻译之中，因为某些有价值的外源蛋白质可能对宿主细胞是有毒的，外源蛋白质的过量表达必将影响细菌的生长，而细胞代谢的损伤又必然影响外源基因的表达。因此，合理的调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平的一个重要环节。所以，在基因表达过程中，宿主细胞的生长和外源基因的表达是分成两个阶段进行的，第一阶段使含有外源基因的宿主细胞快速生产，以获得足够量的细胞；第二阶段是启动调节开关，使所有的细胞的外源基因同时高效表达，以产生大量基因表达产物。这是减轻宿主细胞代谢负荷最常用的方法。

本实验中使用pEasy-Blunt E1表达载体（见图1）含有T7启动子和Olac操纵元件，编码与T7启动子结合的T7 RNA聚合酶的基因位于宿主细胞BL21(DE3）内，该基因受Lac UV5启动子控制。在无IPTG等诱导的时候，T7 RNA聚合酶的编码基因不表达，无T7 RNA聚合酶产生；无T7 RNA聚合酶与T7启动子结合，外源基因不表达。

实验材料：

1、菌株：阳性克隆子大肠杆菌BL21（DE3）（pEasy-Blunt E1：gfp）（实验七验证）

2、试剂：LB培养基，IPTG

3、实验器具：振荡摇床，紫外可见光分光光度计。

实验步骤：

1、将阳性克隆子大肠杆菌BL21（DE3）（pEasy-Blunt E1：gfp）接种于含AMP（50μg/mL）的LB培养基中，37℃ 200rpm 培养过夜；

2、以1%的接种量将培养物接种于50ml含AMP（50μg/mL）的LB培养基中（50mL培养基，250mL三角瓶），37℃ 250rpm以上转速培养至OD600为0.5；

3、在三角瓶中加入250μL IPTG（200μM），使IPTG浓度至1μM，诱导表达3-5h；

4、收获菌体，用于后续SDS-PAGE鉴定。