生物制药综合实验重组质粒模块实验六 重组表达载体pEasy E1-gfp的小量提取及电泳检测
实验目的
1. 掌握碱变性法提取质粒的原理
2. 掌握质粒提取的方法步骤
实验原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。
实验材料
1、菌株：大肠杆菌BL21（DE3）（已转化重组质粒pEasy E1-gfp）；
2、试剂：0.8%琼脂糖凝胶；
3、实验器具：离心机，电泳仪，凝胶成像仪。
实验步骤
1、取1.5ml培养液，8000g离心3min，收集菌体；
2、加入250μl溶液I，充分悬浮菌体；
3、加入250μl溶液II，温和上下翻转4-6次，使菌体充分裂解，直至溶液变透明粘稠。裂解时间不能超过5min；
4、加入350μl溶液III，温和上下翻转，充分混匀。13000g离心10min；
5、将吸附柱放入收集管中，将上清转移至吸附柱，12000g离心30sec，倒掉滤液
6、向吸附柱中加入500μl去蛋白溶液，12000g离心30sec，倒掉滤液；
7、向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000g离心30sec，倒掉滤液；
8、重复步骤7一次；
9、吸附柱12000g离心2min，去除残留漂洗液；
10、取出吸附柱放入一个新的1.5ml离心管，向吸附柱中央滴加50-100μl洗脱液EB，12000g离心一分钟洗脱DNA；
11、琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取效果。
