生物制药综合实验（重组质粒模块）实验七 PCR法验证重组表达载体

实验目的：

1、掌握PCR扩增验证阳性克隆子的原理和方法

2、熟练掌握PCR实验技术

实验原理：

实验一中的DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase扩增的PCR产物为平末端产物（由gfpf和gfpr引物扩增所得），与其对应的实验二中使用的载体pEasy-Blunt E1为线性化的平末端载体（插入位点两侧分别有T7启动子引物（T7P）和T7终止子引物（T7T），两者连接有两种不同的重组方式（见图2），A图中gfp基因正确插入，gfp基因的编码链与载体编码链位于同一条DNA单链上，gfp基因可以正确表达；B图中gfp基因错误插入，gfp基因不能正确表达。

本实验以实验六提前的质粒为模板，使用T7T和gfpf为引物，通过PCR的方法验证正确插入的克隆子。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后能扩增出产物的为重组方式正确的克隆，反之为错误重组方式的克隆。

实验材料：

1. 试剂：Taq DNA 聚合酶；10mM dNTPs；实验六提取的质粒；引物(T7T、gfpf）；0.8% 琼脂糖凝胶；1×电泳缓冲液。

2. 实验器具：PCR仪，凝胶成像仪，电泳仪。

实验步骤：

按照下表配制PCR反应Mixture，每个反应体系25μl。

2.PCR扩增，反应程序见下表：

3. 琼脂糖凝胶电泳检测。