荐读 | 环状RNA（circRNA）在骨肉瘤中的研究进展

2023-05-29 14:40 作者:circRNA官方号 0人读过 | 我要投稿

本文引用格式：倪昊楠,施翔文,郭民政,等.环状RNA(circRNA)在骨肉瘤中的研究进展[J].生物骨科材料与临床研究,2023,20(2):70-75.

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一种起源于间叶组织的原发性恶性肿瘤，好发于长骨干骺端，是儿童和青少年最常见的癌症之一，全球年发病率约为4.8/1 000 000，以出现梭形基质细胞和类骨质为特征，患者的典型症状是局部肿胀、疼痛和功能受限[1-2]。局限型骨肉瘤患者的5年存活率在65%～75%之间[3]，但几乎80%的骨肉瘤患者在确诊前已有转移，化疗耐药或肺转移的患者5年生存率不足20%[4]。随着新辅助化疗和放射治疗的广泛应用，个体化、精准化治疗受到广泛关注，为了突破骨肉瘤治疗的瓶颈期，迫切需要探索骨肉瘤发生发展的新机制，为骨肉瘤的早期诊断和治疗提供有效的干预策略。

非编码RNA（ncRNA）是一类直接从基因组转录但不编码蛋白质的RNA，是人类转录组的主要部分，占所有转录物的98%以上。根据结构和形成机制，ncRNA可分为线形RNA和环状RNA（circRNA），与传统线性RNA相比，circRNA具有闭环结构，表达更稳定，不易降解，这使得circRNA在开发和应用于新的临床肿瘤诊断标志物及其治疗靶点方面具有明显优势。大量研究表明，circRNA是人类癌症发生、发展和转移的重要调节因子，从机制上讲，circRNA可以充当miRNA的分子海绵，并形成复杂的转录后调控网络影响基因表达。最近的研究表明，circRNA在包括骨肉瘤在内的癌症的病理生理学中发挥着关键作用，许多circRNA可以通过其基因调控潜力促进或抑制肿瘤发生及进展[5]。

一、环状RNA的特性及生物学特征

早在1976年，Sanger等[6]就在植物病毒中发现了“单链共价闭合的环状RNA分子”的类病毒。1991年，Nigro等[7]在HCT116等人源细胞中发现转录的circRNA。然而，受当时知识和技术的限制，它们并没有得到充分的研究，而被认为是转录过程中错误剪辑的产物。直至1993年，Capel等[8]发现小鼠睾丸中来自性别决定区域Y基因的特异性circRNA可能具有正常的剪接过程。2012年，Salzman等[9]通过高通量RNA测序（RNA-Seq）首次报道了大约80个环状RNA分子，至此借助于高通量测序技术对环状RNA的研究正式开始进入人们的视野。随后Hansen等[10]首次提出并证实了circRNA可以作为miRNA海绵的调控机制，为circRNA的研究提供了新的方向。随着circRNA功能被逐步揭开，其研究也越来越受到重视。

作为ncRNA的一个特殊亚类，circRNA是一种单链共价闭合的内源性RNA，没有5'端帽和3'poly(A)尾，主要位于细胞质中，对核酸外切酶具有较强的抵抗力，表达稳定且不易降解。大多数真核生物circRNA来自于RNA聚合酶Ⅱ转录的mRNA前体（pre-mRNA），通过单个pre-mRNA的外显子的反向剪接后共价连接而形成[11]。circRNA可以只由外显子组成，也可以只由内含子组成，或者两者兼而有之，它们的大小可以从数个碱基到几千个碱基不等。

1.1circRNA的形成模式

不同的circRNA有不同的连接方式，主要有3种形成circRNA的模式。

1.1.1 内含子配对驱动的环化

内含子配对驱动的环化是由反向互补内含子序列（如人类基因组中的Alu），使剪接供体位点和上游剪接受体位点非常接近从而形成环，即使在典型剪接和反向剪接之间存在竞争时，每个重复序列小于100个核苷酸也足以使外显子环化。

1.1.2 RNA结合蛋白驱动的环化

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）驱动的环化，是由RBP介导的模型，其中某些反式作用因子识别并停靠在位于环化外显子两侧的内含子中的特定基因序列上，创建了一座桥梁，使剪接供体和受体位置足够近，反向剪切形成一个环。另一种剪接因子是由RNA结合蛋白Quakin（QKI）和类肌肉瘤蛋白1（MBNL1）与侧翼内含子结合并形成二聚体，从而使中间的剪接位点非常接近，剪接体参与反向剪接。

1.1.3 套索驱动的环化

套索驱动环化是在线性剪接过程中形成circRNA的过程，外显子跳跃和内含子套索形成，其中共价闭合外显子circRNA的形成是由外显子的3'端（剪接供体位点）连接到同一外显子的5'端（单外显子circRNA）或上游外显子的5'端（多外显子circRNA）开始的，这些环状RNA可能起源于pre-mRNA剪接中的内含子去除过程，或者起源于外显子跳跃中的含有外显子的嵌套[12]。

1.2环状RNA的分类

根据环状RNA的特性可以将其分为以下9种类型：

①外显子circRNA（ecircRNA），占circRNA的主体（75%以上），主要位于细胞质中，从头到尾循环，细胞质中只有一个或几个外显子；

②外显子－内含子circRNA（EIciRNA），EIciRNA由外显子和内含子组成，主要位于细胞核中，这些外显子和内含子保留了反向剪接功能；

③内含子circRNA（ciRNA），ciRNA主要位于细胞核内，由pre-mRNA通过去除外显子并将内含子的头部和尾部紧密连接而产生；

④基因间circRNA，这种circRNA由两个内含子片段之间的序列组成，两侧是GT-AG剪接信号，位于距离两侧两个基因至少1kb的位置；

⑤tRNA内含子circRNA（tricRNA），这种circRNA是由pre-tRNA衍生而来的一种特殊类型的内含子circRNA，含有内含子的前tRNA被内切酶复合体切割，形成内含子转录本和成熟的tRNA，从而形成tricRNA；

⑥反义circRNA，这种circRNA的形成机制与ecircRNA相同，但发生在相反的链上；

⑦重叠的circRNA；

⑧circRNArRNA（circrRNA）；

⑨基因内circRNA，这种类型的circRNA类似于基因间circRNA，但环化序列距离两个基因的两侧不到1kb[13]。

1.3环状RNA的生物学功能

在过去的几十年里，circRNA的多种生物学功能已经被确定，包括miRNA海绵效应、调控基因转录、调控蛋白结合和参与蛋白编码等功能。研究表明，circRNA参与了肿瘤微环境等多方面的生物调节，可以促进或抑制免疫系统和血管生成，改善内皮细胞的通透性，促进癌症转移，并导致细胞外基质重塑，这些因素共同影响了肿瘤的进展[14]。能量代谢改变是肿瘤的一个标志，旨在为肿瘤的发生和发展提供必要的营养，circRNA可以通过与相应的microRNAs结合或直接与蛋白质接触，调节糖酵解、脂肪生成和降解、谷氨酰胺降解和氧化呼吸等，在调节细胞代谢方面发挥着重要作用[15]。

1.3.1 miRNA海绵效应

circRNA与许多类型的miRNA通过与mRNA3-非翻译区（3ʹ非编码区）结合来调节mRNA的转录水平，circRNA可以通过海绵化miRNA来调节miRNA靶基因的表达，从而发挥竞争内源性RNA的作用[16]。近年来，越来越多的证据表明circRNA通过海绵化miRNA在癌症的发展中发挥重要作用，例如，肝癌中的circTRIM33-12[17]、非小细胞肺癌中的circSATB2[18]和胃癌中的circNRIP1[19]等。

1.3.2 调控基因转录

circRNA的功能除了作为miRNA海绵外，还通过直接与RNA聚合酶Ⅱ的结合，调节基因的转录。例如，位于细胞核的EIciRNA与U1snRNA（U1小核糖核蛋白）相互作用后，再与RNA聚合酶Ⅱ结合，调节基因的转录[20]。

1.3.3 调控蛋白结合

RNA结合蛋白（RBP）以转录后调控的方式参与RNA选择性剪接、运输和转录的过程，从而影响细胞的增殖、氧化、衰老、凋亡等过程[21]。circRNA通过与多种RBP稳定结合形成RNA-蛋白质复合体来调节游离RNA结合蛋白的浓度，从而影响mRNA的稳定性和作用效果[22]。例如，肺腺癌中circDCUN1D4作为支架促进HuR（人类抗原R）与TXNIP（硫氧还蛋白结合蛋白）的相互作用，从而提高TXNIP mRNA的稳定性，抑制肺癌细胞的转移和糖酵解[23]。

1.3.4 参与蛋白编码

与线性mRNA一样，circRNA也可以被翻译成蛋白质。一些circRNA还含有一个内部核糖体进入位点，可以直接编码蛋白质，1995年发现了具有内部核糖体进入位点和起始密码子ATG的circRNA[24]，内部核糖体进入位点（IRES）和N6-甲基腺苷（M6A）介导的帽非依赖性翻译启动机制被认为是circRNA翻译的潜在机制[25]。某些circRNA可以直接翻译成蛋白质，例如，CIRC-FBXW7可以翻译成蛋白质FBXW7-185aa，但该蛋白质的功能尚不清楚[26]。

此外，circRNA参与多种癌症类型，并对基因表达、细胞凋亡和细胞周期等产生不同的影响。一些circRNA有很大的潜力，可以作为许多疾病的诊断和预后的生物标志物，特别是癌症[27]。

二、circRNA在骨肉瘤中的作用研究

近年来，随着高通量测序技术的发展，越来越多的证据表明circRNA在骨肉瘤的发展中发挥着重要作用，多种circRNA在骨肉瘤及其癌旁组织中差异表达。一些circRNA已被证明通过参与调控骨肉瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭和糖酵解等多种生物学过程来调节肿瘤的发展和进展。某些异常表达的circRNA与骨肉瘤的临床特征紧密相关，如骨肉瘤的诊断、分期和预后。

2.1circRNA用于骨肉瘤的早期诊断

由于骨肉瘤的发病率很低，且临床症状不具特异性，多数患者1年内出现肺转移，预后较差，因此早期诊断十分关键。X线是骨肉瘤首选的诊断方法，X线表现为致密的干骺端硬化（几乎全部），软组织延伸（75%），Codman三角或日光放射状（60%），骨硬化性病变（45%），溶血性病变（30%）[28]。而血清生物标志物，如C-反应蛋白和碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）是过去诊断骨肉瘤最常见的血清标志物，但其敏感性和特异性差强人意。骨肉瘤的诊断和分型的“金标准”是组织活检，但组织活检是有创检查，大多数患者症状出现较晚且早期出现转移，其诊断具有滞后性。因此，发掘新的方法来进行骨肉瘤的诊断迫在眉睫。

由于circRNA的结构稳定性、进化保守性和器官特异性，不易被RNA酶降解，稳定存在于人组织、血清、唾液及尿液中。He等[29]发现尿液中的细胞外小泡circRNA分类器（包含circPDLIM5、circSCAF8、circPLXDC2、circSCAMP1和circCCNT2）加RCs（PCPT-RC 2.0和ERSPC-RC）预测Ⅱ期及以上的前列腺癌比单独使用RCs更具准确性，且这种检测方法操作简单，具有可重复性和非侵入性，可以很容易地作为基本临床工作的一部分实施。许多在骨肉瘤组织中有显著差异表达的circRNA有望成为骨肉瘤早期诊断和预后的新型生物标志物。例如，Shen等[30]发现CircECE1在骨肉瘤组织和细胞中高表达，且CircECE1能显著促进骨肉瘤细胞的葡萄糖代谢，敲除后能抑制肿瘤的增殖和转移；在机制上，CircECE1与c-Myc相互作用，阻止斑点型POZ介导的c-Myc泛素化和降解，c-Myc抑制硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）转录，进而激活Warburg效应，可以作为早期诊断的依据。Zhu等[31]发现hsa_circ_0081001在患者的骨肉瘤组织中显著上调（P＜0.05），进一步构建诊断模型后提示hsa_circ_00810011（AUC=0.898，P＜0.001）比临床上常用的碱性磷酸酶（AUC=0.673，P=0.026）、乳酸脱氢酶（AUC=0.80，P＜0.05）作为骨肉瘤诊断生物标志物的诊断效能更高。由此可见circRNA作为诊断骨肉瘤生物标志物的潜力。

2.2circRNA参与骨肉瘤的发生及发展

circRNA可作为骨肉瘤的抑癌或促癌分子，如前文所述，circRNA可以通过充当miRNA分子海绵来调控基因的表达，大多数circRNA包含一个miRNA反应元件，可以与miRNA结合并调节其表达，通过下游复杂的调控网络参与骨肉瘤的发生及发展。研究表明，敲除骨肉瘤细胞中的circRNA可通过调节miRNA来调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡等细胞生物学行为，这些发现表明circRNAs可能在骨肉瘤中起关键作用，见表1。

2.3circRNA介导骨肉瘤的耐药

随着新辅助化疗和手术相结合的治疗方法的运用，显著提高了骨肉瘤患者的生存率，然而化疗耐药和早期肺转移的患者的5年生存率仍然很低。因此，深入了解骨肉瘤细胞发生化疗耐药的分子机制，对于开发新的治疗方法并最终改善骨肉瘤患者的预后非常重要。越来越多的证据证明，多种ncRNA，包括miRNA、lncRNA和circRNA在骨肉瘤的进展中起着关键作用，大量的ncRNA异常表达，并通过各种机制调节化疗敏感性[41]。骨肉瘤的一线化疗药物是阿霉素（ADM）、甲氨蝶呤（MTX）和顺铂（DDP）等[42]，近年来大量的研究证明circRNA可以调控化疗药物的敏感性。例如，Zhou等[43]发现circITCH在骨肉瘤中下调，并通过海绵化miR-524上调RASSF6，抑制了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，促进了骨肉瘤细胞的凋亡，同时circITCH过表达可显著提高骨肉瘤细胞对ADM的敏感性。Wei等[44]发现在耐MTX的骨肉瘤组织和细胞中，circ_0081001和2型转谷氨酰胺酶（TGM2）表达上调，miR-494-3p表达下调，circ_0081001通过促进骨肉瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移来增强细胞对MTX的敏感性。Zhang等[45]发现DDP耐药骨肉瘤细胞中circ-CHI3L1.2的表达增加，circ-CHI3L1.2基因敲除可降低DDP的半数抑制浓度（IC50）、降低P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药蛋白1（MRP1）和谷胱甘肽S-转移酶Pi1（GSTP1）的表达水平，可诱导间充质细胞向上皮细胞转化，抑制细胞的迁移和侵袭，促进对DDP耐药骨肉瘤细胞的凋亡。Pan等[46]的研究表明，外泌体可以通过传递circRNAs来介导骨肉瘤细胞的化疗耐药；具体来说，hsa_circ_103801在耐DDP的骨肉瘤细胞外泌体中高度富含，传递后显著降低MG63和U2OS细胞对DDP的敏感性，抑制细胞凋亡。这些异常表达的circRNAs显示出作为骨肉瘤生物标志物和治疗靶点的巨大潜力，并能预测骨肉瘤患者的化疗反应。因此，动态监测这些circRNA，是有效评估骨肉瘤患者化疗反应的一种有价值的方法，利用非编码RNA载体获得多种肿瘤抑制因子修复circRNA，可能是治疗骨肉瘤的一种有前途的治疗策略，靶向circRNA治疗联合常规化疗可有效逆转骨肉瘤耐药，从而为患者选择最合适的治疗方案，提高化疗效果。

2.4circRNA对骨肉瘤的预后监测

circRNA可以调节骨肉瘤的恶性特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和对化疗的耐药性。此外，越来越多的研究表明，调节异常的circRNA与生存率和临床病理参数（临床分期和化疗敏感性）密切相关。circRNA能够通过海绵化作为潜在肿瘤抑制因子的miRNAs来调节PI3K/Akt信号等关键通路，并通过与靶基因（如KLF2和APC）结合影响骨肉瘤患者的预后。Shi等[47]发现circ-MTO1在肿瘤组织中的表达低于非肿瘤组织（P＜0.001），而circ-MTO1表达升高与Enneking分期降低相关（P=0.049），提示新辅助化疗疗效好（P=0.029）和无瘤生存期（disease free survival，DFS）较长（P=0.047）。Lei等[48]发现hsa_circ_0003074在骨肉瘤患者组织、血液和细胞系中均有高表达，化疗或手术后骨肉瘤患者外周血中hsa_circ_0003074的表达水平显著降低，与肿瘤大小（≥8cm）、肺转移、Enneking分期（ⅡB-Ⅲ期）、化疗耐药、复发率、生存率、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶有关。Xiong等[49]通过单样本基因集浓缩分析（ssGSEA）计算骨肉瘤细胞系的上皮－间充质转化（EMT）分数，检测了骨肉瘤细胞系的转移潜能，通过对比转移潜能较高的骨肉瘤细胞系（如HUO3N1、CAL78、hFOB1.19等）和最低转移的骨肉瘤细胞系（NOS1、U2OS、HOS等）的转录比较，发现EMT相关基因显著上调，一些炎症相关通路（如NF-κB信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路和IL-17信号通路）和细胞间通路因这些上调的基因而变得丰富，EMT相关基因在转移潜能较高的骨肉瘤细胞系中显著上调。以上研究结果提示，多种circRNA可能在骨肉瘤患者预后检测中起着关键的调控作用，为骨肉瘤患者优化治疗方案，提高生存率提供了科学依据。

三、小结与展望

通过现有的研究成果可以发现，circRNA具有稳定性、丰富性、特异性等特点，随着检测技术的提升，越来越多有功能的circRNA被证实参与了骨肉瘤的进展，为骨肉瘤的发生、发展、诊断、耐药等相关的分子机制研究提供了新方向。circRNA在充当miRNA分子海绵时可以调节骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移，并且基于其稳定性、特异性和参与基因调控的特征，circRNAs有望成为骨肉瘤的早期诊断、预后和治疗靶标的潜在生物标志物。

circRNA种类繁多且功能复杂，相对于传统的mRNA而言，对circRNA的研究尚处于起步阶段，现有的骨肉瘤研究大多聚焦在circRNA的下游miRNA的分子海绵吸附效应，对于circRNA其他的生物学功能仍需探索，如circRNA的二级结构分析，生成与降解机制，翻译蛋白质机制，参与骨肉瘤发生、发展和转移机制等。仍需进一步的研究和临床试验发现高特异性和高敏感性且适用于临床工作的circRNA，并开发与circRNA相关的新的治疗策略，以克服骨肉瘤的耐药性，从而改善骨肉瘤患者的预后。另外，相信随着技术的革新和研究的深入，circRNA在骨肉瘤中的调控网络将会得到进一步完善，从而实现骨肉瘤的早期诊断、靶向治疗、改善患者预后的目标。

四、作者&通讯作者简介