基因研究揭示眼斑水龟属（Sacalia）潜在遗传多样性
由于栖息地破坏与过度偷猎，我国本土龟鳖类普遍处于严重的生存危机之下。同时，由于物种分类混沌造成的基因污染，又使得本就任重道远的保育工作雪上加霜。2022年末，由北京大学、海南师范大学主导的科研团队对眼斑水龟属物种进行了迄今最详细的系统发育研究。此前，该属长期被认为仅有眼斑水龟和四眼斑水龟两种，且在广东具有分布重叠区。该研究表明，没有证据显示这两个物种目前有同地分布，但在珠江流域存在历史自然杂交留下的稳定杂种种群。该研究也证实了四眼斑水龟是一个复合种，其中海南的种群应提升为种，而广西、越南等地更丰富的遗传多样性仍有待厘清。这些系统发育方面的努力，将有利于保护这群美丽但脆弱的山涧精灵。
文：Eikawa hinmaji、Infinity
眼斑水龟属 (Sacalia) 分布于中国南部及印支半岛东北部，其下有两个物种：东部的眼斑水龟(S. bealei)与西部的四眼斑水龟(S. quadriocellata)。两种在广东有一分布重叠区域。它们头后部的眼状斑点、颈部明亮的竖条纹以及背甲的放射状条纹使它们在一众亚洲龟类中脱颖而出，极受龟类爱好者追捧，也因此饱受非法宠物贸易的荼毒；东亚、东南亚各国的食补传统和民众对“野味”的贪婪追求，更是让所有本土龟类蒙受灭顶之灾。2016年，眼斑水龟属物种的市价猛涨至1000美元/公斤。近年来，该属在野外已经极为罕见，并于2021年被列为国家重点保护野生动物名录的二级保护物种，但仍允许商业化养殖。同时，四眼斑水龟被IUCN红色名录列为极危物种，眼斑水龟被列为濒危物种。
在中国，为满足宠物市场和食用需求，龟鳖类的商业化养殖日益繁荣。不同地域种群乃至不同物种的人工杂交在养殖场中非常普遍，很可能威胁到自然种群的遗传完整性。另一方面，对亚洲龟鳖目的生活史、系统发育和形态特征了解的严重缺乏，可能导致对亚洲隐存龟类多样性的低估 (Gong et al.， 2018)。华鳖属 (Pelodiscus)就是一个很好的例子。 近年来，斑点鳖(P. variegatus), 黄山鳖(P. huangshanensis), 和石片鳖 (P. shipian)等新种接连被发现，而这些分布狭窄、种群脆弱的物种长期被视作中华鳖 (P.sinensis)，被认为分布广泛、野外种群不受威胁而不加节制地利用。
因此，为进一步研究与保护岌岌可危的眼斑水龟属，厘清其内部系统发育关系及不同地理种群的形态差异与分布范围成为一亟待解决的问题。
先前的研究已经揭示眼斑水龟属内部多样性的丰富程度远超我们的想象。2008年，基于已知采集地点的个体与市场样本的CytB（线粒体细胞色素b基因）序列的眼斑水龟属系统发生学研究揭示了S. bealei 和 S. quadriocellata 之间的高度分歧，并确定 S. quadriocellata 包含内部三个亚演化支(东部、西北、西南) (Shi, Fong, et al., 2008; Shi, Parham, et al., 2008)。近期又有两项工作，对这三个演化支做了进一步拆分。首先，针对四眼斑水龟西部种群（即前文的西北、西南演化支）的一项系统发生学研究引入了更多已知采集地点的样本，进一步在越南和老挝确定了五个亚演化支 (Le et al.， 2020)。其次，先前被包含在东支中的海南岛的四眼斑水龟种群与大陆种群相比，表现出明显的形态差异 (Sun, 2015)和线粒体基因组分化(Lin et al.，2020)，因此被识别为一个独立的物种，命名为海南四眼斑水龟Sacalia insulensis (Lin et al.，2018,2020)。
然而，由于在这些研究中，来自中国大陆的已知产地的眼斑水龟属物种样本的代表性不足，因此难以获取该属的系统发育多样性的全貌。除了线粒体系统发生学研究之外，基于核基因的群体遗传结构分析和形态学研究将更好地了解它们的进化、分类和保护。
基于采集自宠物贸易市场的标本，眼斑水龟属的第三个物种拟眼斑水龟 (S. pseuddocellata) 曾被描述，但随后被视为四眼斑水龟和三线闭壳龟 (Cuora trifasciata) 之间的F1杂交个体而废除(Shi, Fong, et al., 2008; Shi, Parham, et al., 2008; Stuart & Parham, 2007)。
然而，研究者近期在两种眼斑水龟的分布重叠区域发现了一形态特殊、兼具两种眼斑水龟特征的种群——这类眼斑水龟在中国的宠物市场长期被视作两种眼斑水龟的杂交。典型的四眼斑水龟头部没有或只有个别点纹，在干净的背景色下，两对相分离的眼斑显得格外醒目。典型的眼斑水龟的头上有密集的黑点，两对眼斑相连且前对轮廓模糊。这些新发现的“杂交龟”乍一看更接近四眼斑水龟，但它们有像眼斑水龟那样，更暗的、几乎相连的眼斑。与之前错误发表的人工杂交的产物“拟眼斑水龟”不同，这类眼斑水龟可能代表了一个未被正式描述的、自然发生的杂交种群。
本研究首次利用全范围的样本数据集，同时应用线粒体和核DNA标记来揭示整个眼斑水龟属的系统地理格局和种群结构，并利用遗传分析和杂交模拟进一步探究了潜在的杂交种的起源。在此基础上，作者为龟类的分类和保护提供了一些建议。
红色为眼斑水龟，剩下的曾经都被归为“四眼斑水龟”。其中，已有研究提议海南的蓝色种群应提升为种。以往的研究中，两种眼斑水龟位于广东的“同域分布区”被广泛援引。然而，根据本文作者的长期调查和大范围采样，发现这两个物种如今的分布范围被珠江流域隔开（上图绿色与红色），并无重叠；但存在历史遗留的自然杂交种群（黄色）。珠江水系可能是本属扩散的天然障碍，因为它们更偏好山间小溪流，而非大河 (Gong et al.，2006; Hu et al.，2016)。
缩写: SBE, 眼斑水龟S. bealei; SHY, 杂交眼斑水龟S. quadriocellata × bealei; SQUen, 四眼斑水龟东北种群northern east S.quadriocellata; SQUwn, 四眼斑水龟西北种群northern west S. quadriocellata; SQUes, 四眼斑水龟东南或海南种群southern east S. quadriocellata or Hainan S. quadriocellata; SQUwc, 四眼斑水龟中西部种群central west S. quadriocellata; SQUws, 四眼斑水龟西南种群southern west S. quadriocellata。
结果
1. 系统发育
研究人员首先对样本的线粒体CytB基因进行了PCR扩增与测序，获得约1140bp读长的一致序列，据此构建系统发育树，将样本划分为7个支系。
基于线粒体Cyt b基因构建的进化树揭示，东部四眼斑水龟由两个亚演化支构成，分别为包括所有采集于中国两广样本的东北亚支(SQUen)和仅分布于海南岛的东南亚支(SQUes)。西部四眼斑水龟分布于越南以及毗邻地区，可以进一步细分为北(SQUwn)、中(SQUwc)、南(SQUws)三个亚支。北支分布于越南北部和邻近的广西（存疑），中支分布于越南中北部与老挝中部，南支分布于越南中部与中南部。所有分布在两广SQUen与SBE过渡分布区的疑似杂交种均包含在北支中，共享3个密切相关的mtDNA单倍型。
研究人员又挑选了16个核基因（长度总计约8.7kb）进行测序，用来检验线粒体基因进化树的正确性，同时探究眼斑水龟的种群遗传结构。
他们聚焦于上述7个支系中的眼斑水龟，四眼斑水龟“珠江”（SQUen）、“海南”（SQUes）、“北越”（SQUwn）种群，杂交种群这5个支系，共87个个体。确定每一个体在16个核基因位点的基因型后，用STRUCTURE软件进行分类，若设置分为3类，可见眼斑水龟、杂交种群与各地的“四眼斑水龟”可以被清晰地区分开来，支持这三类相互之间具有一定遗传独立性；若提高分辨率，设置分为5类，则个体的分类结果与线粒体基因构树的结果大致吻合——这说明系统发育树的结果是得到核基因与线粒体基因双方支持的。
但是，有些个体存在线粒体与核基因来源不一致的情况，说明种群之间，如越南北部种群与广西种群间，可能存在基因渐渗。
左图体现了不同分辨率（K值）下，根据核基因的分类结果。PCA（右图）中部不同颜色互相混合的数据点，反映了聚类与线粒体分类结果不一致的个体，暗示基因渐渗的存在。
2. 种群遗传结构
用75个典型个体代表上述5个种群，研究人员发现，同一种群内部，多数基因都处于哈迪-温伯格平衡状态。而“杂交种群”的杂交身份，也被坐实——它们确实为眼斑水龟和四眼斑水龟珠江种群的后代。
“杂交种群”有没有可能并非杂交后代，而是单纯地理隔离的产物？如果答案是肯定的，那么“杂交种群”的个体与某一亲本种群个体的遗传距离应随着地理距离的增加而显著增加。
结果显示，在3个种群内部（红、黄、绿线），遗传距离随着地理距离的增加而增加；但种群间，遗传距离与地理距离没有关系。因此，作者认为，杂交种群（绿色）并不是某个种群地理隔离形成的产物。
我们知道，在杂交事件发生后，杂交种群中一个基因位点会存在两种等位基因，分别来源于两个祖先种群。当杂交种群再次与母本种群隔离后，这两个等位基因要么因自然选择，要么因遗传漂变，只剩下一个留存在种群中，这就是等位基因的固定（fixation）。
本文在16个基因中鉴定了8个在眼斑水龟、四眼斑水龟珠江种群中差异较大的基因。比较发现，在杂交种群中，这8个基因大多数已经固定，仅存某一亲本特有的等位基因。根据粗略的计算，假设种群中每代有100个个体，则基因经过随机的遗传漂变达到这种程度的固定需要100代以上的时间（大约500年）。考虑到真实情况比计算模拟复杂很多，比如历史上有效种群远大于100及亲本持续的基因渐渗，该自然杂交种群的隔离时间可能远比模拟结果更长。
有趣的是，该杂交种群的线粒体基因完全是四眼斑水龟珠江种群的类型——可能线粒体经过遗传漂变，或杂交具有固定的性别偏向，如雄性眼斑水龟倾向于和雌性四眼斑水龟交配，反之则不行。这个问题，或许需要更多的生态学与行为学数据才能解答。
3. 形态学区分
结论
本研究对眼斑水龟属种群的遗传多样性、地理分布和基因流进行了全面的分析。在该属中发现了6个线粒体亚支，表明其多样性高于预期。系统发育分析表明海南四眼斑水龟(SQUes)构成一个独特的支系且为遗传地位最为孤立的种群，这与之前的研究一致(Lin et al.，2020)。形态学方面的研究同样表明，海南和中国大陆的个体在体型大小、头部和壳的形状以及腹甲斑块形状与面积等方面均存在显著差异。此外，海南四眼斑水龟在地理上与其他种群隔离，符合生殖隔离和生态位分化的条件。因此，有充分证据支持将海南四眼斑水龟提升至种的地位（也就是 S. insulensis ）。然而这一提升将使剩下的四个亚演化支成为并系群。接下来，应收集更充分的基因和形态学证据，将每个亚支提升为种。但目前，采样密度的局限性阻碍了对四眼斑水龟复合种更为全面的拆分。SHY符合杂交分类单元的定义，即“一个独立进化的、历史稳定的种群或一组种群，具有来自两个或多个离散亲本分类单元的遗传特征的独特组合”(Allendorf et al.，2001)。因此，应将其作为一个独立的自然杂交种单独对待，即 S. quadriocellata x bealei。这也是中国首个被报道的龟类自然杂交种群。综上所述，眼斑水龟属应被视作是七个不同的进化显著单元，在人工圈养繁殖中应该避免杂交。本研究的精细采样显示了中国南方眼斑水龟丰富的遗传多样性，揭示了亚洲淡水龟类巨大的隐存多样性，强调了该地区进一步开展两栖爬行动物学研究和保护的紧迫性。
原文
Lin, L., Chen, H., Gaillard, D., Shi, H. and Luo, S. (2022). Phylogeography of the endangered ‘eyed’ turtles (genus Sacalia) and the discovery of a lineage derived from natural interspecific hybridization. Ecology and Evolution, 12(12). doi:10.1002/ece3.9545.
