细胞免疫检测指标详细步骤

小鼠脾淋巴细胞分离及体淋巴增殖试验

小鼠脾淋巴细胞的分离

首免后42天，每组取5只小鼠，取眼球采血后处死，分离脾淋巴细胞，具体操作步骤如下；

1、将采血后的小鼠脱颈处死后放入75%酒精中浸泡5min消毒，在超净台内无菌操作分离脾脏，浸泡于RPMI-1640培养基（添加1%的双抗）中。

2、研磨：在小皿中加入10ml RPMI-1640培养基，放置细胞滤网，用研磨棒在滤网中将脾细胞研磨成单个细胞，巴氏吸管吸取脾细胞悬液，再次经过滤网过滤，转移至离心管中，1000rpm/min离心10min。

3、裂解红细胞：弃上清，加入5ml红细胞裂解液重悬洗涤细胞，置于37℃温箱裂解15min，1000rpm/min离心10min。

4、洗涤：弃掉上清，加入10ml RPMI-1640培养基重悬洗涤细胞，1000rpm/min离心10min，重复洗涤两次。

5、计数：用5ml 10%FBS RPMI-1640培养基重悬脾淋巴细胞，使用细胞计数仪对细胞进行计数，调整细胞浓度至1x107cell/ml备用。

脾淋巴细胞增殖检测

脾淋巴细胞在体外经过某种物质刺激，会产生一系列增殖的变化，据此可以判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态，本实验通过CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞在体外刺激后的增殖能力，具体操作步骤如下：

1、将制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔100ul（1x106 cells）。

2、检测孔每孔加入10ul多肽，阳性对照孔每孔加入10ul RPMI-1640稀释的ConA（终浓度5ug/ml）,阴性对照孔每孔加入10ul RPMI-1640培养基。向细胞板最外侧一圈加入100ul培养基防止内侧孔内液体蒸发影响实验结果。将细胞板置于37℃，5%CO2培养箱中培养44h。

3、每孔加入10ul CCK-8溶液，再培养4h。

4、取出细胞板，使用酶标仪读取OD450nm值。

ELISASpot检测小鼠分泌IFN-r/IL-4的淋巴细胞数量

T淋巴细胞免疫激活后，CD4+T细胞分化为Th1和Th2细胞，IFN-r是Th1型细胞的标志性细胞因子，IL-4是Th2型细胞的标志性细胞因子。为了检测特异性T淋巴细胞反应，通过ELISASpot测定小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-r/IL-4的细胞数量，具体操作步骤如下：

1、预包被板的活化：向预包被板中每孔加入200ul RPMI-1640培养基，室温静置5-10min进行活化，甩掉孔内培养基。

2、细胞孵育：每孔加入制备好的脾淋巴细胞悬液100ul（1x106 cells），背景负对照孔 加入等量的RPMI-1640培养基。检测孔每孔加入10ul多肽，阳性对照孔每孔加入10ul阳性刺激工作液，负对照孔、背景负对照孔加入10ul RPMI-1640培养基。37℃，5% CO2培养箱孵育18h.

3、裂解细胞：弃去（倾倒）孔内细胞及培养基，加入冰冷的去离子水，200ul/孔，4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞。

4、洗板：甩出孔内液体，加入1xWashing buffer 260ul/孔，静置1min后弃去，在吸水纸上扣干，重复6次。

5、孵育检测抗体：将稀释的Biotiny lated antibody 加入实验孔，100ul/孔，37℃孵育1h。

6、酶联亲和孵育：洗板后，将稀释好的Streptavidin-HRP加入实验孔，100ul/孔，37℃孵育1h。

7、洗板：甩出孔内液体，加入1xWashing Buffer，260ul/孔，静置1min后弃去，在吸水纸上扣干，重复5次，揭开板子底座，用去离子水洗涤膜底面及底座，用吸水纸小心吸干膜底面及底座残留的水迹，合上底座，加入1xWashing Buffer，260ul/孔，静置1min后弃去，彻底扣干孔内液体。

8、显色：配制ACE显色液，加入各实验孔，100ul/孔，37℃温箱避光15min，根据斑点生成情况选择终止显色时间。

9、终止显色：甩出孔内液体，揭开板子底座，用去离子水洗涤膜底面及底座3-5遍，终止显色。将板子放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。

10、使用Mabtech ASTOR ELISpot读板仪进行斑点计数并分析。

物品清单

8.27的细胞免疫检测-物品清单

4%的多聚甲醛-固定淋巴结

巴氏吸管

红细胞裂解液

FBS血清

15ml离心管

刀豆蛋白

表位多肽

细胞计数板

70目网筛

研磨棒

1640培养基

双抗

50ml离心管

灭菌剪刀镊子

75%的酒精

泡沫板

针头固定