生物化学 药立波 b站视频配套 第二十一章：DNA重组及重组DNA技术
第二十一章：DNA重组及重组DNA技术
重组DNA技术：是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。
第一节：自然界的DNA重组和基因转移
一：同源重组是最基本的DNA重组方式
同源重组=基因重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
二：位点特异性重组是发生在特异位点间的DNA整合
（一）入噬菌体DNA的整合
（二）细菌的位点特异性重组
（三）免疫球蛋白基因的重排
三：转座重组可使基因移位
（一）插入序列转座
（二）转座子转座
四：原核细胞可通过结合、转化和转导进行基因转移或重组
（一）接合作用
（二）转化作用
（三）转导作用
第二节：重组DNA技术
重组DNA技术=分子克隆=DNA克隆=基因工程技术：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制，扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。
一：重组DNA技术中常用的工具酶
限制性核酸内切酶=限制性内切酶=限制酶=re：是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键
二：重组DNA技术中常用的载体
载体：是为携带目的外源DNA片段，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
（一）克隆载体
1.克隆载体应具备的基本特点
2.常用的克隆载体
质粒，噬菌体DNA等
3.表达载体
1.原核表达载体
2.真核表达载体
三：重组DNA技术的基本原理及操作步骤
（一）目的DNA的分离获取-分
1.化学合成法
2.从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA
3.Pcr法
4.其他方法
（二）载体的选择与构建-选
（三）目的DNA与载体连接-接
1.黏端连接
2.平端连接
3.黏-平末端连接
（四）重组DNA转入受体细胞-转
1.转化
2.转染
3.感染
（五）重组体的筛选-筛
1.借助载体上的遗传标志进行筛选
2.序列特异性筛选
3.亲和筛选法
（六）克隆基因的表达
1.原核表达体系
2.真核表达体系
第三节：重组DNA技术在医学中的应用
一：重组DNA技术广泛应用于生物制药
二：重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面
第二十二章：基因结构与功能分析技术
第一节：基因结构分析技术
一：基因一级结构解析技术
（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法
（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于sanger双脱氧法
1.四色荧光法
2.单色荧光法
（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测定技术
（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术
（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术
二：基因转录起点分析技术
（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定tss
Tss=基因的转录起点
（二）用5；-cDNA末端快速扩增技术鉴定tss
（三）用数据库搜索tss
三：基因启动子结构分析技术
（一）用pcr结合测序技术分析启动子结构
（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构
1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点
2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子
（三）用生物信息学预测启动子
1.用启动子数据库和启动子预算法定义启动子
2.预测启动子的其他结构特征
四：基因编码序列分析技术
（一）用cDNA文库法分析基因编码序列
（二）用rna剪接分析法确定基因编码序列
（三）用数据库分析基因编码序列
五：基因拷贝数分析技术
第二节：基因表达产物分析技术
一：通过检测rna而在转录水平分析基因表达
（一）用核酸杂交法检测rna表达水平
1.用rna印迹分析rna表达
2.用核糖核酸酶保护实验分析rna水平及其剪接情况
3.用原位杂交进行rna区域定位
（二）用pcr技术检测rna表达水平
1.用逆转录pcr进行rna的半定量分析
2.用实时定量pcr进行rna的定量分析
（三）用基因芯片和高通量测序技术分析rna表达水平
1.基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法
2.用循环芯片测序技术分析基因表达谱
二：通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平分析基因表达
（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽
（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽
（三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽
（四）用流式细胞仪分析表达特异蛋白质的阳性细胞
（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平
1.用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱
2.用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱
第三节：基因的生物学功能鉴定技术
一：用功能获得策略鉴定基因功能
（一）用转基因技术获得基因功能
（二）用基因敲入技术获得基因的功能
二：用功能失活策略鉴定基因功能
（一）用基因翘楚技术使基因功能完全丧失
（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失
1.用rna干扰技术研究基因功能
2.用mirna技术研究基因功能
3.用反义rna技术研究基因功能
4.核酶技术
三：用随机突变筛选策略鉴定基因功能
