生物化学 药立波 b站视频配套 第二十章：常用分子生物学技术的原理及其应用

第二十章：常用分子生物学技术的原理及其应用

第一节：分子杂交与印迹技术

分子杂交技术：利用DNA变性与复性这一基本性质，结合印迹技术和探针技术，可进行DNA和rna定性或定量分析。

（一）印迹技术

将琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中变性使其变成单链，然后将硝酸纤维素膜放在胶上，将胶中的DNA转移到nc膜上，使之成为固相化分子。将载有DNA单链分子的nc膜放在杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或rna单链分子就可以结合到存在于nc膜上的DNA分子上。

（二）探针技术

探针：指的是带有特殊可检测标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用于检测核酸样品中存在的特定基因。

二：印迹技术的类别及应用

印迹技术可以分为DNA印迹、rna印迹和蛋白质印迹三大类。

（一）DNA印迹

DNA印迹=southern印迹：dna样品经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝胶在变性溶液中处理后，再将胶中的DNA分子转移到nc膜上并使DNA固定在nc膜上，即可用于杂交反应。DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析。

步骤：

（二）rna印迹

Rna印迹=northern：其技术原理与DNA印迹相同，但rna分子较小，转移前无需进行限制性内切酶切割。Rna印迹技术主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mrna的表达水平，也可比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。

（三）蛋白质印迹

蛋白质印迹=免疫印迹=western：先将混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到nc膜上，首先用第一抗体与转移膜上相应的蛋白质分子结合，然后用碱性磷酸酶标记的第二抗体与之结合，反应之后用放射自显影来检测蛋白质区带的信号，蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。

第二节：pcr技术的原理与应用

一：pcr技术的工作原理

Pcr=聚合酶链反应：以拟扩增的DNA分子为模板，在引物和DNA聚合酶作用下，依半保留机制沿模板链延伸直至完成2条新链合成。重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

反应步骤：

1.变性：将反应体系加热至94度，使模板DNA完全变性称为单链

2.退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA结合

3.延伸：将温度升至72度，DNA聚合酶以dntp为底物催化DNA的合成反应。

上述三个步骤为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。

二：pcr技术的主要用途

（一）目的基因的克隆

（二）基因的体外突变

（三）DNA和rna的微量分析

（四）DNA序列测定

（五）基因突变分析

三：几种重要的pcr衍生技术

（一）逆转录pcr技术

（二）原位pcr技术

（三）实时pcr技术

第三节：基因文库

基因文库：指的是一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆载体。基因文库可分为基因组DNA文库和cDNA文库

一：基因组DNA文库

基因组DNA文库：以DNA片段的形式储存着某一生物的全部基因组DNA信息。

二：cDNA文库

cDNA文库：包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mrna经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存这该组织细胞的基因表达信息。

第四节：生物芯片技术

一：基因芯片技术

基因芯片：是指将许多特定的DNA片段有规律得紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测，比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。

二：蛋白质芯片

蛋白质芯片：将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白质样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。

第五节：生物大分子相互作用研究技术

一：蛋白质相互作用研究技术

（一）标签蛋白沉淀

（二）酵母双杂交技术的原理和用途

二：DNA-蛋白质相互作用分析技术

（一）电泳迁移率变动分析

染色质免疫沉淀技术