今天介绍的是丁肝病毒(Hepatitis Deltavirus/HDV/DV)。

简介

       丁肝病毒(HDV)是五种已知的肝炎病毒[甲肝病毒(正义RNA病毒，肝病毒/Hepatovirus)、乙肝病毒(拟逆转录病毒，肝炎DNA病毒/Hepadnavirus)、丙肝病毒(正义RNA病毒，丙肝病毒/Hepacivirus)、丁肝病毒(类病毒/反义RNA病毒，丁肝病毒/Deltavirus)和戊肝病毒(正义RNA病毒，戊肝病毒/Hepevirus)]中最小的病毒，也是唯一感染人类的类病毒。它被认为是卫星病毒，因为它只能在存在HBV感染的情况下传播。HDV的传播既可以通过同时感染HBV（合并感染）发生，也可以叠加在慢性HBV或HBV携带者状态（超感染）上。 与单独感染HBV相比，HDV的双重感染和合并感染均导致更严重的并发症。这些并发症包括在急性感染中发生肝衰竭的可能性更大，并迅速发展为肝硬化，

在慢性感染中罹患肝癌的风险增加。HBV-HDV混合感染在所有肝炎感染中的死亡率最高，为20％。

病毒结构与基因组

       丁肝病毒是一种直径为36nm的小型球形病毒。它的外层含有三种HBV包膜蛋白：大、中、小HBV表面抗原，以及围绕内部核衣壳的宿主脂质。核衣壳包含每个基因组1682个核苷酸(丁肝病毒1型/HDV-1/DV-A/Hepatitis D virus A/Hepatitis Deltavirus A/Deltavirus A)的单链环状RNA和约200个分子的D型肝炎抗原（HDAg，又名德尔塔抗原）。HDAg的中央区域已显示与RNA结合。HDAg的N末端的卷曲螺旋区域也介导了几种相互作用。由于丁肝病毒的环状基因组具有较高的GC核苷酸含量，因此在动物病毒中是独一无二的。HDV基因组以反义单链闭合环状RNA的形式存在，它的核苷酸序列具有70％的自我互补性，使基因组可以形成部分双链的杆状RNA结构。HDV具有约1700个核苷酸的基因组，是已知感染动物的最小“病毒”。有人提出，HDV可能由一类叫做类病毒(Viroid)的植物病原体进化而成。

病毒生活周期

        像乙肝病毒一样，丁肝病毒通过NTCP胆汁转运体进入肝细胞。丁肝病毒通过乙肝表面抗原(HBsAg)的N端结构域识别其受体。该区域的突变定位显示，氨基酸残基9-15构成了受体结合位点。在进入肝细胞后，病毒未被包裹，核衣壳由于HDAg中的信号而易位到细胞核。由于丁肝病毒基因组不编码RNA聚合酶来复制病毒的基因组，病毒利用宿主细胞的RNA聚合酶。最初被认为仅使用RNA聚合酶II，现在RNA聚合酶I和III也被证明参与HDV的复制。通常RNA聚合酶II利用DNA作为模板并产生mRNA。丁肝病毒是唯一已知的能够使用宿主RNA聚合酶作为RNA依赖的RNA聚合酶的动物病原体。

        RNA聚合酶将RNA基因组作为双链DNA处理，这是由于它是折叠的棒状结构。丁肝病毒RNA有三种形式：圆形基因组RNA、圆形互补的反基因组RNA和线性多聚腺苷化的反基因组RNA，这是包含HDAg开放阅读框的mRNA。反基因组RNA的合成发生在核仁中，由RNA聚合酶I介导，而基因组RNA的合成发生在核浆中，由RNA聚合酶II介导。HDV RNA首先被合成为线性RNA，其中包含许多基因组的副本。基因组和反基因组RNA包含一个由85个核苷酸组成的序列，即丁肝病毒核酶，它作为一种核酶，可以将线性RNA自裂解成单体。这些单体然后连接形成环状RNA。

德尔塔抗原

        类病毒和HDV之间的显着区别是，尽管类病毒不产生蛋白质，但HDV可以产生一种蛋白质，即HDAg。它有两种形式：一个27kDa的HDAg-L和一个24kDa的HDAg-S。两种形式的N末端相同，它们在HDAg-L的C末端相差19个氨基酸。两种同工型都是从同一阅读框产生的，该阅读框在196位密码子处包含一个UAG终止密码子，通常仅产生HDAg-L。然而，通过宿主细胞腺苷脱氨酶-1的编辑将终止密码子更改为UGG，从而可以产生HDAg-L。尽管具有90％相同的序列，但这两种蛋白在感染过程中起着不同的作用。HDAg-S在感染的早期产生，并进入细胞核并支持病毒复制。相反，HDAg-L是在感染后期产生的，可作为病毒复制的抑制剂，是病毒颗粒组装所必需的。因此，细胞酶系对RNA的编辑对于病毒的生命周期至关重要，因为它调节了病毒复制和病毒体装配之间的平衡。

抗原性环

        HDV包膜蛋白具有三个锚定在其上的HBV表面蛋白。基因组的S区最常表达，其主要功能是组装亚病毒颗粒。 HDV抗原蛋白可与病毒基因组结合形成核糖核蛋白（RNP），当被病毒样颗粒包裹时，可形成与成熟HDV几乎相同的病毒样颗粒，但它们没有传染性。研究人员得出结论，HDV的传染性决定因素在大蛋白（L）的N末端pre-S1域内。发现它是与细胞受体结合的介质。最近，研究人员Georrges AbouJaoudé和Camille Sureau发表了一篇文章，研究了在HDV包膜蛋白中发现的抗原环在病毒的传染性中的作用。像大蛋白的N端pre-S1结构域一样，抗原环也暴露在病毒体表面。 Jaoudé和Sureau的研究提供了证据，表明抗原性环可能是HDV进入宿主细胞的重要因素，并且通过突变抗原性环的某些部分，可以将HDV的感染力降至最低。

传染方式

        HDV的传播途径与HBV相似。感染主要限于HBV高危人群，尤其是注射吸du者和接受凝血因子浓缩剂的人群。在全球范围内，有超过1500万人被共同感染。HDV在大多数发达国家很少见，并且主要与静脉吸du有关。然而，HDV在地中海地区、撒哈拉以南非洲、中东和南美北部地区更为普遍。总共可能有大约2000万人感染了HDV。防护措施HBV疫苗可预防HDV，因为后者依赖于存在的HBV才能复制。因为没有针对丁肝病毒的特定疫苗，所以必须在出生后不久在危险人群中接种针对HBV的疫苗。

发现历史

        丁肝病毒最早于1977年中报道，是患有严重肝病的HBV感染患者的一种核抗原。然后，该核抗原被认为是HBV抗原，被称为德尔塔抗原。随后在黑猩猩中进行的实验表明，德尔塔抗原（HDAg）是病原体的结构部分，需要HBV感染才能复制。整个基因组在1986年被克隆并测序。随后将其置于自己的属中：丁肝病毒(Deltavirus)。在鸭子中也有类似的病毒，禽丁肝病毒中编码的蛋白质与丁肝病毒具有32％的同源性。蛇中还发现了另一种类似的病毒，它被命名为蛇丁肝病毒(Snake Deltavirus)。

以下四种病毒也被发现：

1.白蚁HDV抗原(寄主：长鼻白蚁/Schedorhinotermes intermedius)

2.蟾蜍HDV抗原(寄主：中华大蟾蜍)

3.蝾螈(Newt)HDV抗原(寄主：东方蝾螈)

4.鱼类HDV抗原

丁肝病毒抗原型

丁肝病毒共有八个抗原型：

抗原1.HDV-1/DV-A/DVA(世界广泛分布)

抗原2.HDV-2/DV-B/DVB(分布于东亚、东北亚)

抗原3.HDV-3/DV-C/DVC(分布于南美洲北部)

抗原4.HDV-4/DV-D/DVD(分布于东洋)

抗原5.HDV-5/DV-E/DVE(分布于西非几内亚湾沿岸)

抗原6.HDV-6/DV-F/DVF(分布于刚果河沿岸)

抗原7.HDV-7/DV-G/DVG(分布于刚果河沿岸)

抗原8.HDV-8/DV-H/DVH(分布于刚果河沿岸)

丁肝病毒核酶(Hepatitis Deltavirus Ribozyme/HDV-Rz)

        丁肝病毒是唯一已知的拥有核酶活性的人类病毒。丁肝病毒核酶(HDV-Rz)是在丁肝病毒中发现的非编码RNA，是病毒复制所必需的，在丁肝病毒的复制过程中，丁肝病毒核酶通过自我切割反应将RNA转录物加工成单位长度，据认为是通过双滚环机制的。丁肝病毒核酶在没有任何蛋白质因子的情况下在体内具有活性，并且在发现时是已知最快的自然发生的自我裂解RNA。

       后来，锤头状核酶(Hammerhead Ribozyme)也被发现。

      丁肝病毒核酶的晶体结构已使用X射线晶体学进行了解析，并显示了由一个双假结连接的五个螺旋段。

      除了正义基因组版本，所有丁肝病毒病毒还具有丁肝病毒核酶的反基因组版本。该版本不是确切的互补序列，但采用与正义基因组相同的结构。两者之间唯一的“显着”差异是P4茎上的小凸起和较短的J4/2接头。基因组核酶和反基因组核酶都是复制所必需的。

丁肝病毒样核酶

       丁肝病毒核酶在结构和生化上与许多其他自切割核酶有关。 由于这些相似性，即使在丁肝病毒中未发现这些其他核酶，也经常将其称为丁肝病毒核酶的实例。 它们也可以称为“丁肝病毒样”以表明这一事实。
       类似于丁肝病毒核酶的核酶包括哺乳动物CPEB3核酶，逆转座子成员(例如昆虫和L1Tc中的R2 RNA元件以及锥虫的可能的其他逆转座子)和细菌序列。这种分组可能是趋同进化的结果：在发现的非人类丁肝病毒也具有丁肝病毒核酶，并且尚无提出的水平基因转移方案可以解释这一点。

催化机理

        丁肝病毒核酶催化底物核苷酸或寡核苷酸与核酶的5'-羟基之间磷酸二酯键的断裂。在丁肝病毒中，这种底物核苷酸序列始于尿苷，被称为U(-1)，然而，-1核苷酸的身份并不会显著改变催化速率。这只对它的化学性质有要求，因为正如Perrotta和Been所示，U(-1)核糖被脱氧核糖取代会使反应废去，这与化学反应中2'-羟基是亲核试剂的预测是一致的。因此，与其他许多核酶(如锤头核酶)不同，丁肝病毒核酶没有催化的上游要求，只需要一个单一的-1核糖核苷酸作为底物即可有效反应。

       最初，人们认为核酶中的第75个核苷酸，一种称为C75的胞嘧啶，能够作为一般碱，C75的N3从U(-1)核苷酸的2'-羟基上提取一个质子，以促进对磷酸二酯键的亲核攻击。然而，虽然已经确定C75的N3的pKa偏离了正常值4.45，接近于6.15或6.40，但它还不够中性，不能作为一般的碱催化剂。相反，C75的N3被认为是一种刘易斯酸，以稳定核糖酶的剩余5'-羟基;这是因为它靠近晶体结构中的5'-羟基。如果C75核苷酸被其他核苷酸取代，则核酶的活性会被抵消或显著削弱，尽管这种活性可以通过咪唑部分恢复，进一步说明C75在催化活性中的作用。

       丁肝病毒核酶中的C75因其特有的pKa而一直是研究的对象。游离核苷的典型pKa值在3.5到4.2之间；这些较低的pKa值是酸性的，不太可能变成碱性的。然而，核糖酶内部的结构环境，包括一个溶解的活性位点裂口，可能提供了负静电势，这可能会扰乱胞嘧啶的pKa，足以起到路易斯酸的作用。

        除了对5'-羟基离开基的路易斯酸稳定外，现在也认为丁肝病毒核酶可以利用金属离子协助激活2'-羟基来攻击U(-1)核苷酸。核酶活性部位的一个镁离子与2'-羟基亲核试剂和易剪切磷酸盐的一个氧相协调，并可作为路易斯酸激活2'-羟基。此外，U23的磷酸可以作为一个路易斯酸，从2'-羟基接受一个质子，镁作为配位离子。由于丁肝病毒核酶不需要金属离子才能具有活性，因此它不是一种专性的金属酶，但活性部位镁的存在显著改善了裂解反应。丁肝病毒核酶似乎对低数量的二价阳离子的折叠具有非特异性要求，在Mg2+、Ca2+、Mn2+和Sr2+中具有活性。在没有金属离子的情况下，水似乎可以取代镁作为一种路易斯酸的作用。

来自上游RNA的调控

       受丁肝病毒核酶快速自裂解性质的限制，以前的核糖核酸酶实验是在自裂解的3'产物而不是前体上进行的。然而，已知侧翼序列参与调节丁肝病毒核酶的自切割活性。因此，已经整合了自切割位点的上游序列5'来研究HDV核酶的最终自切割活性。已经确定了两种替代结构。
       第一个抑制性结构被一个扩展的转录物折叠（即-30/99转录物，参照自身切割位点的座标），从切割位点上游的30 nt到3'端下游的15 nt延伸。在转录过程中，侧翼序列将核酶隔离在动力学陷阱中，并导致自我切割率大大降低。这种防止自我切割的结构包括3个备选茎：Alt1，Alt2和Alt3，它们破坏了活性构象。 Alt1是一个10bp的长距离相互作用，由抑制性上游区段(-25/-15nt)和下游区段(76/86nt)形成。Alt1破坏了茎的P2活性构象，其中P2被认为对基因组和反基因组核酶都具有激活作用。Alt2是上游侧翼序列与核酶之间的相互作用，而Alt3是非天然核酶-核酶之间的相互作用。
        各种实验方法都支持这种抑制构象的二级结构。首先，进行了通过核糖核酸酶的直接探测，随后使用来自探测结果的约束通过mfold 3.0进行的建模与所提出的结构一致。其次，使用一系列与AS1/2不同区域互补的DNA寡聚物来拯救核酶的活性。结果证实了AS1/2的抑制作用。第三，突变分析在核酶之外引入了单/双突变，以确保观察到的核酶活性与Alt1的稳定性直接相关。发现AS1的稳定性与自我切割活性成反比。
        第二个允许结构使丁肝病毒核酶能够自我转录共转录，并且该结构还包括RNA转录本的-54/-18nt部分。来自上述抑制构象的上游抑制性-24/-15片段现在被隔离在位于裂解位点上游的发夹P(-1)中。然而，P(-1)基序仅存在于基因组序列中，这可能与被感染的肝细胞中基因组HDV RNA拷贝更为丰富的现象有关。实验证据也支持这种替代结构。首先，由于该结构的快速切割性质，通过核糖核酸酶的结构定位被用来探测-54/-1片段而不是整个前体转录物，这与局部发夹P(-1)(在-54/-40和-18/-30nt)。其次，在21个基因组HDV RNA分离株中，在P(-1)以及P(-1)和P1之间的连接区域发现了进化保守性。

用于RNA转录本制备

        丁肝病毒核酶裂解反应的特殊性质使其成为制备具有均质3'端RNA转录物的有用工具，这是用T7 RNA聚合酶转录RNA的替代方法——T7 RNA聚合酶转录RNA时通常会产生异质末端或不希望的添加。核酶的cDNA版本可以与目标RNA序列的cDNA和通过T7 RNA聚合酶转录制备的RNA相邻制备。核酶序列将有效地自我切割，而无需下游要求，因为-1核苷酸是不变的，留下了一个2'-3'环状磷酸酯，可以通过用磷酸酶或T4多聚核苷酸激酶处理轻松去除。然后可以通过凝胶纯化来纯化靶RNA。