20-羟基蜕皮甾酮激活FoxO以促进棉铃虫蜕皮期间的蛋白水解

写在前面

        今天推荐的是由山东大学生命科学学院团队在2016年3月15日发表于Development（IF：5.596，JCR 2区）的一篇文章，通讯作者是Xiao-Fan Zhao教授，研究表明在棉铃虫蜕皮过程中，20-羟基蜕皮甾酮（20E）通过上调PTEN表达来激活FoxO从而促进蛋白水解。

研究背景

        FoxO在各种细胞的生理过程中具有不同功能，包括调控大鼠交感神经元凋亡基因的表达、果蝇的细胞分化和小鼠骨骼肌的自噬。FoxO的活性在胰岛素（insulin）途径中被抑制。在insulin调节下，FoxO被Akt磷酸化并维持在细胞质中，从而抑制其转录活性。当阻断该通路时，FoxO不会被磷酸化而是转移至细胞核以启动基因转录。PTEN是insulin信号通路的负调控因子，其功能是抑制Akt的磷酸化。

        FoxO的表达可被类固醇激素20-羟基蜕皮甾酮（20E）上调。20E诱导FoxO的高表达与核定位，从而在家蚕蜕皮和蛹化期间上调brummer和酸性脂肪酶-1的表达，并促进脂肪体细胞的脂解。较高浓度的20E会抑制棉铃虫中胰岛素诱导的基因表达。在果蝇中，FoxO与USP相互作用以介导蜕皮激素的生物合成。这些研究表明20E可通过激活FoxO诱导蜕皮和变态过程，但其中的分子机制尚不清楚。

摘要部分

        本研究旨在确定20E对FoxO活性的调控机制。作者发现，在棉铃虫蜕皮和变态过程中，20E促进了FoxO的表达，而FoxO的敲低抑制了幼虫的蜕皮和20E调控基因的表达。研究表明，20E通过上调PTEN表达抑制了胰岛素诱导的Akt磷酸化，从而抑制FoxO磷酸化以及诱导FoxO的核定位。在细胞核中，FoxO直接调控BrZ7的转录，从而促进蜕皮过程中羧肽酶A（CPA）的表达。因此，FoxO是蜕皮过程中20E诱导蛋白水解的关键调控因子。

研究内容

1.20E在蜕皮和变态过程中诱导FoxO的表达

        作者首先通过转录组测序鉴定出棉铃虫的FoxO基因，分析发现其基因序列相对保守。然后作者检测了FoxO在棉铃虫的表皮、中肠和脂肪体的表达谱。结果显示，与摄食期相比，这些组织中的FoxO蛋白水平在蜕皮期和变态期明显升高。此外，作者将20E注射到六龄6h幼虫体内，观察到了FoxO转录本的增加。相比之下，juvenile激素III（JH III）不能诱导FoxO。因此20E在棉铃虫蜕皮和变态期间上调了FoxO的表达。

研究结论：FoxO可能被20E诱导表达从而参与蜕皮和变态过程。

2.FoxO的敲低抑制幼虫蜕皮以及20E通路的基因表达

        为探究FoxO的功能，作者将FoxO dsRNA（dsFoxO）注入五龄6h幼虫中以下调FoxO表达。实验显示，FoxO的敲低不会影响20E核受体EcRB1和USP1的表达，但显著抑制了转录因子BrZ7和CPA的表达。另外，FoxO敲低也明显阻碍了幼虫的蜕皮。统计表明，当沉默FoxO时，62％的幼虫未能脱落旧表皮进入第六龄期，并最终死亡。

         作者发现，当FoxO被敲低时，皮层溶离无法发生且旧的角质层不能从表皮中分离。此外，在dsGFP对照组的老表皮和表皮中检测到CPA蛋白，而在dsFoxO处理的幼虫表皮中未能检测到CPA蛋白。这表明FoxO通过调控CPA表达以实现蛋白水解。

 研究结论：FoxO通过调控20E通路中EcRB1和USP1下游的BrZ7和CPA的表达，从而在蜕皮过程中发挥关键作用。

3.20E抑制HaEpi细胞中FoxO磷酸化并调控FoxO的核定位

        作者通过免疫组化探究了表皮中FoxO的亚细胞定位。实验发现，与5F相比，5M和变态期的表皮在细胞质和细胞核中均能检测到FoxO，且其在细胞核中的水平增加。另外，蛋白印迹显示了上下两条FoxO条带，5F阶段时上带占优势，而5M和6-72h时下带占主导。实验表明，上带是FoxO的磷酸化形式。磷酸化的FoxO分布在细胞质中，而非磷酸化的FoxO分布在细胞核中。

         作者发现，FoxO与20E孵育6h后，其在细胞核中的定位增加。蛋白印迹证实了20E孵育后细胞核中非磷酸化的FoxO增加。进一步研究发现，饥饿条件下的FoxO主要定位于细胞核，胰岛素的添加使FoxO从细胞核转移到细胞质。然而，添加20E后，FoxO显示出越来越多的核定位。

研究结论：FoxO在进食阶段主要被磷酸化并位于细胞质中，而在蜕皮和变态阶段主要被去磷酸化并位于细胞核中。另外，20E可以抑制FoxO磷酸化并诱导FoxO定位于细胞核。

4.20E抑制Akt磷酸化以降低FoxO的磷酸化

        为揭示20E抑制FoxO磷酸化的机制，作者分析了Akt在胰岛素诱导FoxO磷酸化中的作用。WB显示胰岛素在15min内诱导了FoxO的磷酸化。然而，Akt的敲除显著抑制了胰岛素诱导的FoxO磷酸化。这表明胰岛素通过Akt诱导FoxO磷酸化。当胰岛素诱导FoxO磷酸化时，也会诱导Akt磷酸化。反过来，当20E抑制胰岛素诱导的FoxO磷酸化时，Akt磷酸化也被抑制。

 研究结论：20E抑制胰岛素诱导的Akt磷酸化，从而抑制FoxO磷酸化

5.20E通过上调PTEN表达来抑制Akt磷酸化

        接下来作者探究了PTEN在20E抑制Akt磷酸化中的作用。实验显示，蜕皮变态过程中Akt的磷酸化降低，PTEN表达增加。20E诱导3h后PTEN表达上调，此时Akt未被磷酸化。进一步研究表明，20E直接调控PTEN表达。作者发现，敲低EcRB1或USP1显著降低了20E诱导的PTEN表达。这说明20E通过EcRB1和USP1上调PTEN表达。此外，敲除PTEN时，20E不能抑制胰岛素诱导的Akt磷酸化。

 研究结论：20E通过促进PTEN表达抑制了Akt磷酸化。

6.FoxO在20E诱导过程中直接调控BrZ7的转录   

        作者在BrZ7基因的上游区域发现了一个FoxOBE序列（5′-TTGTTTAA-3′）。ChIP显示，在转染空载的免疫沉淀物中检测到少量含有FoxOBE的DNA片段。相反，在20E诱导的pIEx-4-FoxO-GFPHis转染细胞的免疫沉淀物中获得了大量含有FoxOBE的DNA片段，但DMSO或JH III孵育的细胞中没有获得。进一步分析表明FoxO在20E诱导过程中与BrZ7的近端启动子区特异结合。

        从DMSO处理的细胞中分离的FoxO被磷酸化，但从20E处理的细胞中分离的FoxO未被磷酸化。为了证实非磷酸化的FoxO直接与FoxOBE结合，作者用地高辛（Dig）标记的FoxOBE探针和FoxO-GFP-His蛋白进行EMSAs实验。结果显示DMSO处理的细胞中FoxO-GFP-His并没有移动探针。然而，20E诱导的细胞中FoxO-GFP-His被检测到一个明显的位移。此外，当未标记的FoxOBE探针用作竞争性抑制剂时，探针与FoxO-GFP-His的结合力降低。

 研究结论：非磷酸化的FoxO与BrZ7的FoxOBE结合，从而直接调控BrZ7的转录。

7.20E调控的级联基因表达

        为研究20E诱导过程中的级联基因表达，作者分别敲低了EcRB1、USP1、FoxO和BrZ7。结果发现，在HaEpi细胞中敲低EcRB1或USP1可以抑制20E诱导的FoxO、BrZ7和CPA的表达。敲低FoxO抑制了BrZ7和CPA表达，但没有抑制EcRB1和USP1的表达。BrZ7的敲低可以抑制CPA表达，但不能抑制FoxO表达。

 研究结论：20E通过EcRB1和USP1上调FoxO表达，进而促进BrZ7表达，最终诱导CPA表达。

结论与讨论

        研究表明，胰岛素诱导Akt磷酸化，然后Akt诱导FoxO的磷酸化和细胞质定位，从而促进幼虫生长并产生更多20E。然而高水平的20E会通过EcRB1和USP1上调PTEN和FoxO的表达。PTEN抑制Akt的磷酸化.从而抑制FoxO磷酸化。非磷酸化的FoxO会转移到细胞核中，并直接与BrZ7上游区域的FoxOBE结合以诱导BrZ7转录。最终,BrZ7通过调控CPA表达促进蜕皮过程中的蛋白水解。

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原文链接：https://doi.org/10.1242/dev.128694