原位杂交探针类型

图1.一些最常用的 DNA (A-C) 和 RNA 探针合成方法 (D) 的表示。

 杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间，因此基于 DNA 或 RNA 的探针可用于定位给定样品中的 DNA 或 RNA。 然而，这些不同类型的探针并不等同，必须选择最适合实验的选项。 例如，值得考虑的是，RNA-RNA 杂交体比 RNA-DNA 杂交体更稳定，而 RNA-DNA 杂交体又比 DNA-DNA 杂交体更稳定。 根据 ISH 目标，这种稳定性差异会影响探针性质的选择。

DNA 探针是 DNA 片段，其中包含对目标染色体区域具有特异性的核苷酸序列。 最常用的合成方法之一是尼克平移反应，分两步进行（图 1A）。 首先，用低浓度的 DNAse I 酶处理模板 DNA（通常是细菌人工染色体 [BAC]），随机切割 DNA，产生游离的 3'-OH 基团。 后者将在第二步中充当引物，此时 DNA 聚合酶 I 将通过 5'-3' 核酸外切酶活性去除核苷酸，同时延长 3'-OH 基团。 反应混合物中可用的修饰核苷酸随后将掺入新合成的链中，从而允许标记探针。 聚合酶链式反应 (PCR) 是另一种常见的 DNA 探针合成方法：目标序列的扩增可以在适当标记的引物（末端标记 PCR，图 1B）或反应混合物存在的情况下实现 可以包含标记的 dNTP，因此反应产物在合成时被标记（连续标记 PCR，图 1C）。 基于 DNA 的 ISH 更常用于检测细胞核中的特定 DNA 序列，例如识别潜在的基因扩增、缺失、易位和染色体数目。

RNA 探针是一段单链 RNA，用于通过杂交检测互补核酸序列的存在。 RNA 探针可以通过体外转录高效且一致地产生。 这样做的常见策略是克隆要在两个相反方向的启动子之间转录的 DNA，以便使用适当的聚合酶合成有义或反义 RNA。 在这种情况下，通过掺入修饰的核苷酸，RNA 探针在转录时被连续标记，从而产生具有高度标记掺入的探针（图 1D）。 此外，由于 RNA 探针是从线性化模板合成的，因此所有探针分子的长度都是一致的。 RNA 探针提供了几个与其使用相关的关键优势，包括相对于 DNA 探针的改进信号。 然而，由于 RNA 的内在不稳定性和对 RNase 降解的敏感性，必须像对待任何其他 RNA 制剂一样小心对待 RNA 探针。 RNA ISH 主要用于研究基因转录，从而研究细胞水平的基因表达。