ChatGPT创始人吃的抗衰药二甲双胍，中国学者花7年找到作用靶点

二甲双胍激活AMPK之谜

简单罗列一下AMPK的激活原理，AMPK由α、β、γ三大亚基构成，每个亚基又分为多个结构域。

最经典的AMPK激活方式是：当细胞内AMP增多时， LKB1（肝激酶 B1）被激活，它可以直接磷酸化AMPK的α亚基Thr172位点（苏氨酸172），激活AMPK；AMP增多也可通过直接结合γ亚基CBS区域变构激活AMPK。

图注：AMPK结构示意图

除该经典方式，AMPK还有以下几种活化方式：

①ADaM位点可被水杨酸盐或一些人造化合物激活，从而轻微上调AMPK活性（见上右图ADaM位点）；

②在基因损伤压力下，细胞中钙离子增高，可通过CaMKK2信号活化AMPK；

③细胞葡萄糖不足时，醛缩酶Aldolase引发溶酶体表面V-ATPase变构，又刺激到LKB1与AMPK接触，从而使Thr172磷酸化、AMPK活化。

二甲双胍通过上述哪种方式激活AMPK？

2000-2010年若干论文声援了“二甲升高AMP，走最经典激活通路”的说法，使其成为主流猜想。就既有研究结论看，动物实验需按照240mg/kg大剂量给药，才会抑制呼吸链复合体I、减少ATP。

虽然即使人类每天口服1.5-2.0g二甲双胍，其引发的血药浓度最大值波动在5-30μM，远低于240mg/kg动物给药的125-150μM，但仍有不少抗衰老爱好者担心每天口服二甲双胍会损伤线粒体、得不偿失。

图注：线粒体氧化呼吸（来源：cusabio.com）

上周，“吃胍”群众们的心总算被厦门大学林圣彩院士发表于Nature正刊的论文安抚放下了。

在人人都想来片二甲延寿的今天，本文可谓正能量满满：首次以常规口服剂量二甲双胍作研究对象，深入揭秘起效原理，低剂量二甲双胍只在细胞内小规模激活AMPK，不干扰ATP生成，且仍发挥降糖、减脂、抗衰益处。

低剂量二甲双胍激活AMPK，

但不抑制ATP

研究伊始，林圣彩团队首先自证口服“临床二甲双胍治疗剂量”的吸收情况。他给予临床受试者500mg格华止®️缓释片（派派掐指一算，这是读者朋友们相对容易接受的剂量），定点抽血测定受试者体内的药物浓度，发现口服格华止3小时即可在血液中达到药物浓度峰值（差不多4μM），12小时又逐渐趋于平静。

图注：服用500mg格华止缓释片后人体血药浓度变化

接下来，研究团队在离体细胞模拟500mg格华止®️给药，正式进入低剂量二甲双胍作用机制的勘测之旅。

他们用5μM二甲双胍“浸泡”哺乳动物肝原代细胞（可理解为“从肝脏直接取下的新鲜细胞”），果不其然，肝细胞的AMPK在用药2小时起就被激活（下图左），但细胞内ATP、AMP、ADP比值却无明显变化（下图右），这与大剂量给药截然不同。

此外他们还观察到一个有趣现象：细胞溶酶体发生了脱羧反应，这暗示低剂量二甲双胍起效很可能与溶酶体有关。

图注：细胞内的溶酶体

脱羧反应常发生于体系pH升高时，这使研究人员将目光投向溶酶体表面名为V-ATPase质子泵，它负责将溶酶体pH维持在4.5到6.5。经验证，低剂量二甲双胍处理溶酶体仅需1小时，V-ATPase的活性就大幅下降(下图左)，其质子交换能力也被抑制（下图右）。

图注：（+）表示使用二甲双胍，

（-）表示未使用二甲双胍

发现二甲双胍全新靶蛋白PEN2

二甲双胍抑制溶酶体ATPase在先，激活AMPK在后，三者如何在给药后互相“接头”？

研究团队设计了一种二甲双胍“探针”MET-P1，它可像钓鱼一样钓出与二甲双胍结合的蛋白。

既然二甲双胍激活AMPK得经过溶酶体，那就把钓鱼范围锁定在溶酶体。在纯化溶酶体内所有蛋白提取物后，探针从中薅出了113种蛋白；使用慢病毒介导的shRNA让这100多种蛋白质“消失”，发现当缺失了名为PEN2的蛋白，二甲双胍就不能再抑制溶酶体V-ATPase活性，AMPK也无法随之激活。

图注：MET-P1探针在纯化的溶酶体蛋白中“钓鱼”

PEN2就是低剂量二甲双胍激活AMPK的必备蛋白，通过进一步质谱分析，发现二甲与PEN2的准确结合位置在PEN2的F35、E40位点。

至此，全新的二甲双胍靶蛋白被发现了。

PEN2到底是什么东西？

PEN2（早老素增强因子-2），是γ-分泌酶复合物的一个基团，日常参与的工作可谓“如雷贯耳”、“令人发指”：将名为APP的淀粉样前体蛋白催化水解为Aβ淀粉样蛋白，助推老年痴呆发生发展。

图注：γ分泌酶是跨膜蛋白，PEN2（红）为一个组成部分

这么看来，“接应”二甲双胍不是PEN2的天性，大概只能算“兼职”。

低剂量二甲双胍激活AMPK，

竟与葡萄糖饥饿“殊途同归”

发现低剂量二甲双胍的全新靶蛋白已经令人兴奋，为厘清AMPK活化前每一个步骤，研究团队继续深挖溶酶体V-ATPase如何被“二甲双胍、PEN2”组合影响。

通过质谱分析等技术，筛选出123种与PEN2发生关系、常驻溶酶体中的蛋白，最终成功锁定V-ATPase的辅助蛋白ATP6AP1，它的420-440氨基酸残基正是与PEN2与V-ATPase结合的位点。

至此我们获得的结论是：低剂量二甲双胍与PEN2结合，二者一起募集到溶酶体V-ATPase复合体的ATP6AP1蛋白上，即可导致V-ATPase空间构象发生改变，V-ATPase活性被抑制。

图注：PEN2与ATP6AP1结合

（红色虚线圈出结合位点）

V-ATPase活性被抑制，最终为何轮到AMPK被激活？

在溶酶体表面，V-ATPase质子泵与名为Ragulator的蛋白结合在一起，共负责感应细胞内营养、能量短缺或充足。

当营养充足时，V-ATPase活性良好，呈下图左“盛开模样”，这种空间构象有助于mTORC1复合体募集Ragulator，激活mTOR信号，让细胞进行合成代谢；当能量短缺时，V-ATPase活性被抑制，呈下图右“收缩模样”，这种空间构象有利于把LKB1募集到溶酶体膜，接触并激活AMPK，让细胞进行分解代谢。

图注：V-ATPase与Ragulator在溶酶体表面调控AMPK、mTOR。为方便阅读，本推文不格外对溶酶体(lysosome)/内体（endosome）作区分

因为V-ATPase-Ragulator感应器周围的“空间有限”,mTOR、LKB1只能有一种“落座”，这注定了AMPK、mTOR当下的活化/抑制状态是对立的。

研究团队对低剂量二甲双胍→PEN2→ ATP6AP1→V-ATPase → Ragulator → LKB1 → AMPK进行环环验证，也确认二甲就是借用PEN2这个“中介”搭上了溶酶体活化AMPK、抑制mTOR的列车。

林院士通过探索二甲双胍作用机制，引出了AMPK活化的全新分支路径。

看到这里的朋友或许可以回头看本文开头，AMPK活化机制中“葡萄糖饥饿”也是经过V-ATPase→Ragulator→LKB1→AMPK来调控AMPK、mTOR活性——这条溶酶体激活路径并不是某种物质专属，是一条进化保守的代谢调节路径，更可能是AMPK很青睐的激活路径（而不是“备胎”）。

令人敬佩的是，这条正变得越来越“经典”的AMPK活化路径，也是林院士团队发现的。

相关研究最早于2014年发表于Cell Metabolism杂志，彼时破除了人们 “葡萄糖不足则ATP不足，从而由AMP经典通路激活AMPK”的猜测，不仅被评为2017年度“中国生命科学十大进展”，“V-ATPase→Ragulator→LKB1→调控AMPK、mTOR活性”甚至被国际学者命名为“林通路”。

图注：二甲双胍、葡萄糖饥饿均共享“林通路”激活AMPK

至此我们对低剂量二甲双胍起效机制进行小结：低剂量二甲双胍，享有全新靶蛋白PEN2，在PEN2的帮助下进入“林通路”激活AMPK，该过程而不需要抑制ATP生成；且与葡萄糖饥饿、热量限制“殊途同归”。

论文正文分享到此告一段落，细细回味方才察觉其中正能量。

首先，它平息了常规口服剂量二甲双胍激活AMPK的原理争议，不仅排除了损伤ATP合成的忧患，甚至找到了全新靶蛋白PEN2，毋庸置疑是一项伟大的开创工作。

其次，二甲双胍经PEN2汇入“林通路”，也从深层论证了“二甲双胍是优秀的热量限制模拟物”这一观点，AMPK激活剂有很多，想必二甲双胍正是因对热量限制的高度模拟特性，才能在健康功效上冠绝群雄吧。

再者，我们不得不感叹本文用心之良苦，全文围绕“低剂量”，而该剂量的设定（约等于口服500mg格华止®️），对时光派读者而言可谓非常“贴心”。

最后，PEN2的发现有助于人们开发二甲双胍的更优替代品。二甲双胍需要OCT蛋白转运入胞，然而OCT蛋白仅在肝脏、小肠、肾脏富集，因此“神药”药效很大程度被局限于这些脏器中。如能筛选或从头合成瞄准PEN2、ATP6AP1蛋白的新分子，则有望开发新的、靶器官更广泛的AMPK激活剂，做出全身逆龄的“强效不老药”。

作为重要的调节寿命信号通路，AMPK通路如何构成？对机体稳态作用几何，我们该如何去科学调控？

时光派为广大读者精心录制了最全面、细致的AMPK科普，无论是抗衰领域的小白，还是有一定基础的老玩家，都能从中有所收获！

您可在评论区留言解锁延寿资料，专栏内更有全球顶尖抗衰研究者、人类长寿基因发现者Nir Barzilai博士和衰老九大标识提出者、端粒领域绝对权威Maria Blasco博士带来的大咖课程等你解锁~

—— TIMEPIE ——

这里是只做最硬核续命学研究的时光派，专注“长寿科技”科普。日以继夜翻阅文献撰稿只为给你带来最新、最全前沿抗衰资讯，欢迎评论区留下你的观点和疑惑；日更动力源自你的关注与分享，抗衰路上与你并肩同行！

参考文献

[1] El-Mir, M. Y. et al. Dimethylbiguanide inhibits cell respiration via an indirect effect targeted on the respiratory chain complex I. J. Biol. Chem. 275, 223-228 (2000).

[2] Owen, M. R., Doran, E. & Halestrap, A. P. Evidence that metformin exerts its anti-diabetic effects through inhibition of complex 1 of the mitochondrial respiratory chain. Biochem. J. 348, 607-614 (2000).

[3] Hawley, S. A. et al. Use of cells expressing γ subunit variants to identify diverse mechanisms of AMPK activation. Cell Metab. 11, 554-565 (2010). [4] Zhang, C. S. et al. Fructose-1,6-bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK. Nature 548, 112-116 (2017).

[5] Graham, G. G. et al. Clinical pharmacokinetics of metformin. Clin. Pharmacokinet. 50, 81-98 (2011).

[6] Hunter, R. W. et al. Metformin reduces liver glucose production by inhibition of fructose-1- 6-bisphosphatase. Nat. Med. 24, 1395-1406 (2018).