USP10通过去泛素化和稳定YAP/TAZ促进肝细胞癌的增殖
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今天推荐的是由浙江大学药学院在2020年3月26日发表于Cancer Research（2020IF：12.702，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Bo Yang教授，研究表明USP10通过去泛素化和稳定YAP/TAZ促进肝细胞癌的增殖。
研究背景
Yes 相关蛋白 (YAP) 及其旁系同源物、具有PDZ 结合基序 (TAZ) 的转录共激活因子在促进肝细胞癌的进展中发挥关键作用。然而，肝细胞癌中支持YAP/TAZ异常激活的调控机制仍不清楚。
摘要部分
在这项研究中，作者全面分析了去泛素化酶 (DUB) 对肝细胞癌模型中YAP/TAZ转录活性和蛋白质丰度的贡献，并确定了泛素特异性肽酶10 (USP10) 作为有效的YAP/TAZ激活DUB。从机制上讲，USP10通过恢复它们的蛋白水解泛素化直接与YAP/TAZ相互作用并稳定它们。USP10的敲低增强了YAP/TAZ的多泛素化，促进了它们的蛋白酶体降解，并最终在体外和体内阻止了肝细胞癌的增殖。USP10的表达水平与肝细胞癌患者样本以及亚硝基二乙胺 (DEN) 诱导的肝癌小鼠模型中YAP/TAZ的丰度呈正相关。总的来说，这项研究建立了USP10与肝细胞癌细胞中过度活化的YAP/TAZ之间的因果关系，并为治疗具有高水平YAP/TAZ的肝癌患者的潜在治疗干预提供了理论依据。
研究内容
1.鉴定USP10作为YAP/TAZ信号的新调节器
作者首先通过监测YAP/TAZ依赖性转录荧光素酶报告基因进行了功能增益筛选。其中，USP10 siRNA 对YAP/TAZ-TEADs荧光素酶活性的抑制作用最强。为了进一步证实USP10对YAP/TAZ信号传导的调节作用，作者使用 WWTR1荧光素酶融合构建体进行了另一次筛选。两种荧光素酶报告系统都表明USP10以最佳方式诱导YAP/TAZ介导的转录反应。另一方面，内源性USP10的缺失有力地降低了YAP/TAZ的转录活性以及蛋白质丰度。一致地，在HepG2和Bel-7402细胞中引入外源USP10也大大上调了YAP/TAZ的蛋白质水平。
研究结论：鉴定USP10作为YAP/TAZ信号的新调节器，USP10可以正向调节YAP/TAZ的蛋白质稳定性和转录功能。
2.USP10通过去泛素酶活性稳定YAP/TAZ
作者在HepG2和Bel-7402细胞系中过表达USP10的WT或催化失活突变体（CA），并发现 WTUSP10而非CA突变体增加了YAP/TAZ蛋白水平。稳定表达对照 shRNA 或USP10shRNA 的细胞用放线菌酮（一种蛋白质合成的通用抑制剂）处理。半衰期分析表明，TAZ蛋白在USP10缺陷细胞中更加稳定。总之，这些结果表明USP10通过去泛素化酶活性调节YAP/TAZ稳定性。
作者试图进一步确认USP10通过泛素-蛋白酶体途径调节YAP/TAZ的周转。用蛋白酶体抑制剂MG132处理USP10缺陷细胞后，作者发现因USP10敲低而降低的YAP/TAZ蛋白质水平恢复了。作者接下来检查了YAP/TAZ的下游靶标，发现USP10的缺失显着降低了YAP/TAZ的靶基因Birc5和CYR61的表达水平。相比之下，MG132 对YAP/TAZ降解的破坏减轻了Birc5和CYR61水平的降低。
为了确定USP10是否直接调节YAP/TAZ，作者进一步研究了USP10如何影响YAP/TAZ的上游激酶 LATS1/2。无论是USP10过表达还是USP10敲低都不会导致 LATS1、LATS2 或 p-LATS1发生显着变化，因此排除了这些典型上游调节因子通过USP10参与YAP/TAZ调节的可能性。此外，作者通过将b-TrCP和Cullin 1转染到HEK293FT细胞中，进一步评估了USP10拮抗E3连接酶介导的TAZ降解的能力，发现TAZ蛋白水平如预期的那样下调，而USP10过表达消除了TAZ降解。
研究结论：USP10以蛋白酶体依赖性方式调节YAP/TAZ稳定性及其下游活性。
3.USP10与YAP/TAZ相互作用并使其去泛素化
随后作者探究USP10是否通过与这对直接相互作用来调节YAP/TAZ。作者将外源性TAZ和USP10转染到HEK293FT细胞中，共免疫沉淀（co-IP）测定表明TAZ确实与USP10发生了物理相互作用。重要的是，作者单独转染了TAZ，结果显示TAZ也可以与内源性USP10相互作用。在与抗 Flag 抗体的相互co-IP中，还发现外源USP10与TAZ-GFP融合蛋白接触，其中引入了GFP标记以更好地说明TAZ信号。一致地，内源性USP10也与TAZ共同IP。类似的结果证明了YAP-USP10相互作用。此外，作者进一步证实了USP10和YAP/TAZ之间的内源性相互作用，这与从内源性水平的co-IP实验中获得的数据一致。
接下来，作者试图探究USP10是否可以去除YAP/TAZ的多泛素化。USP10而非USP10-CA 的过表达显着降低了YAP/TAZ的泛素化水平。一致地，USP10敲低显着增加了泛素化TAZ的水平。然后作者使用细菌表达的USP10在体外进行了去泛素化分析。另一方面，纯化的USP10在体外也能有效地去泛素化YAP/TAZ。
研究结论：USP10直接与YAP/TAZ相互作用并使其去泛素化，进一步证实USP10作为DUB调节YAP/TAZ。
4.USP10敲低通过抑制YAP/TAZ通路来损害肝细胞癌细胞和异种移植肿瘤的生长
许多研究已经证明YAP/TAZ促进肝细胞癌细胞增殖。作者因此探究USP10是否可以通过介导YAP/TAZ来影响肝细胞癌的进展。作者发现在HepG2中稳定沉默USP10会明显抑制细胞生长，如SRB试验和集落形成实验所测量的那样。此外，在那些USP10缺陷细胞中，TAZ的蛋白质水平明显下调。
为了进一步证实YAP/TAZ参与USP10对肿瘤生长的调节，作者将YAP WT 或YAP-5SA突变体引入USP10缺陷细胞。YAP-5SA 缺乏五个丝氨酸磷酸化残基，主要位于细胞核中。只有核定位的YAP-5SA，而不是YAP WT，避免了USP10敲低增强的细胞质降解，并逆转了细胞增殖和集落形成的减少。
接下来，为了验证USP10对体内细胞生长的影响，作者将缺乏USP10的HepG2细胞皮下注射到裸鼠中，并每2天测量一次肿瘤大小。USP10的敲低几乎完全抑制了HepG2异种移植肿瘤的生长。作者进一步检查了USP10在肝细胞癌患者来源的异种移植 (PDX) 模型中的功能。慢病毒载体的瘤内注射递送USP10 shRNA 显着延迟 PDX 肿瘤生长。为了进一步阐明USP10抑制是否能够干扰异种移植模型中的YAP/TAZ通路，作者接下来检测了YAP和TAZ的瘤内蛋白水平，并发现 shUSP10治疗的PDX肿瘤中YAP和TAZ显着降低。这些数据共同表明，抑制USP10通过抑制YAP和TAZ丰度来阻止体内肿瘤生长。为了证实YAP/TAZ在USP10调节的体内肿瘤生长中的作用，作者评估了核驻留的YAP-5SA 突变体对USP10 shRNA 介导的HepG2异种移植肿瘤的肿瘤抑制的影响。USP10 shRNA完全阻断了肿瘤生长，而YAP-5SA的引入减弱了USP10 shRNA介导的生长抑制，表明对YAP的调节作用对于USP10促进体内肝细胞癌肿瘤的生长至关重要。
研究结论：USP10敲低通过抑制YAP/TAZ通路来损害肝细胞癌细胞和异种移植肿瘤的生长。
5.USP10表达与YAP/TAZ水平和患者肝细胞癌风险呈正相关
为了进一步研究USP10是否参与了肝细胞癌形成的病理改变，作者在 C57BL/6 小鼠中建立了DEN 诱导的肝细胞肿瘤发生模型然后进行HA染色以验证肿瘤形成。作者发现USP10和YAP/TAZ的表达在肿瘤区域比在同一肝脏的非肿瘤区域显着升高。此外，作者使用IHC染色评估了肝癌患者的微阵列组织中USP10和YAP/TAZ的表达。大多数肿瘤标本表达大量的USP10和YAP/TAZ。此外，在USP10和YAP/TAZ水平之间发现了统计学上显着的相关性。
接下来，我们试图通过使用癌症基因组图谱（TCGA）数据库和Kaplan-Meier绘图仪分析来确认USP10的临床意义。结果发现大多数人肝细胞癌样本的USP10表达水平明显高于非肿瘤组织。值得注意的是，USP10表达水平与患者患肝细胞癌的风险相关，这促使作者调查USP10表达升高是否可以预测肝细胞癌患者的不良预后。正如Kaplan-Meier绘图仪分析所示，USP10的表达与肝细胞癌患者的无进展生存期（PFS）呈负相关，突出了USP10在肝细胞癌的发生发展和预后中的关键作用。此外，在肝细胞癌患者中检测到USP10的表达水平与YAP/TAZ靶基因的表达水平之间存在明显的正相关，这一发现与作者的IHC染色结果一致。
研究结论：SP10通过稳定YAP/TAZ促进肝细胞肿瘤发生，可作为肝细胞癌治疗的潜在治疗靶点。
结论与讨论
总之，作者研究确定USP10为一种新型去泛素化介质,可稳定肝癌中的YAP/TAZ并增强下游致癌反应。USP10在肝癌组织和DEN诱导的肝细胞肿瘤发生中的高丰度证实了USP10作为一种重要的肿瘤促进因子，是肝细胞癌干预的新治疗靶点。
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原文链接：https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-19-2388
