酵母单杂交技术原理

酵母单杂交（One-hybrid system，Y1H）:蛋白质与DNA序列间相互作用关系

我们先来回顾一下酵母双杂技术原理

如下图为酵母双杂原理图：

     将Bait蛋白和Prey蛋白分别与转录因子GAL4的两个结构域融合表达。如果Bait和Prey蛋白能结合，复合物就会依靠BD结构域识别报告基因的上游结合序列，依靠AD结构域，激活下游报告基因的表达。

UAS: Upstream Activation Sequence  上游结合位点

对于酵母单杂：

酵母单杂交（One-hybrid system，Y1H）

酵母单杂交的检测是基于猎物蛋白和诱饵DNA的相互作用。

诱饵序列位于报告基因的上游，可启动下游报告基因的转录

如上图，简单来说，酵母单杂需要将BaitDNA序列整合进入酵母基因组中，将Prey蛋白构建到AD载体中，与转录因子GAL4的AD结构域融合表达。如果Prey蛋白能够识别并结合BaitDNA序列，Prey蛋白所融合表达的AD结构域就可以招募转录复合物以激活报告基因的表达。

在酵母单杂交实验中需要用到两个载体  

载体1：诱饵载体 ，它含有蛋白质可以与之结合的诱饵DNA，需要整合到酵母基因组中

将选择的目的基因（诱饵）整合到载体中，诱饵序列可以是启动子、调控序列辅助元件或任何此类序列。

将诱饵载体整合入酵母基因组------产生带有目的基因的酵母报告株。

载体虽然整合到了酵母基因组中，但报告基因未表达。（我们需要AD转录激活域）

第二个载体为猎物载体，它包含编码猎物蛋白的基因和转录激活结构域AD。

这样表达的蛋白是两种基因的融合蛋白。该载体还含有标记基因可用于筛选。

将猎物载体转化到先前培养的酵母报告株中，转化成功的酵母菌株可以在缺乏组氨酸和亮氨酸的培养基上生长。

在酵母单杂交的检测中，

如果猎物蛋白与诱饵序列相互作用，可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶启动下游报告基因的转录，在筛选培养基上可观察到阳性菌落。

如果猎物蛋白不与诱饵序列相互作用，则转录激活结构域无法激活RNA聚合酶启动下游报告基因的转录。因此，在筛选培养基上无法观察到阳性菌落。