综合分析USP1在肝癌中的重要作用
写在前面
今天推荐的是由浙江大学医学院及第一附属医院团队在2020年10月发表于Cell Proliferation（IF：5.243，JCR 2区）的一篇文章，通讯作者是Lanjuan Li教授，研究表明USP1参与调控肝癌的肿瘤进展，是一个很有前景的治疗靶点，具有良好的预后价值。
研究背景
原发性肝癌具有很高的死亡率，仍是全球性的健康挑战，其中肝细胞癌（HCC）最为常见。目前肝癌的治疗重点主要是早期诊断，转移和复发的预防等，但晚期患者的治疗选择仍然有限。因此，进一步了解HCC的肿瘤发生和发展机制以及寻找新的治疗靶点仍是当前研究的重点。
近年来，越来越多的证据揭示了泛素化在肿瘤发生中的关键作用，泛素化可能抑制或促进癌症的发生与发展。去泛素化酶通过去除泛素分子来介导底物去泛素化，从而防止底物蛋白被降解。人类基因组中共有100多种去泛素酶，包含泛素特异性蛋白酶（USP）、泛素C末端水解酶、卵巢肿瘤蛋白酶等。如果去泛素化酶的底物起抑癌作用，则去泛素酶会阻止其被降解并起抑癌作用，但如果它们的底物是肿瘤促进因子，那么去泛素酶将抑制其被降解并促进肿瘤发展。因此，靶向去泛素酶是HCC的一种潜在的新型治疗方法。
摘要部分
在本研究中，作者使用多种信息学工具来研究USP1在HCC中的表达谱和其对HCC的预后意义。作者发现USP1在HCC中高表达并且与肿瘤的免疫浸润呈正相关，揭示USP1作为肝癌治疗的新靶点。此外，作者还通过分析USP1及其辅助因子WDR48的基因，探讨了USP1在HCC中的潜在分子机制。研究发现USP1和WDR48可以共同通过细胞周期调控癌细胞增殖。这项研究的结果可能会提高我们对USP1在HCC中的认识。
研究内容
1.USP1在肝癌中高表达
在Oncomine数据库中进行数据挖掘后，作者发现USP1的mRNA表达在许多类型的癌症中都升高了，例如肝癌，肉瘤和膀胱癌。多个数据库的分析结果表明，与正常组织相比，USP1的表达在肝癌组织中显著上调。作者也使用HPA数据库分析了USP1蛋白的表达，发现大多数类型的癌症均表现出USP1染色阳性。在正常肝中未检测到USP1，在HCC肝中显示弱至中度的USP1染色。
为提高结果的可靠性，作者使用UALCAN数据库进一步验证USP1的高表达。分析发现，与正常样品（n=50）相比，LIHC样品（n=371）中USP1的mRNA表达升高，并且USP1在肝癌的不同亚组中也被上调。另外，作者根据癌症分期和肿瘤等级进行分析，结果发现USP1在1-3期和1-4级中有过表达的现象。
研究结论：USP1在肝癌中的表达水平普遍较高，并且USP1的高表达与HCC的肿瘤进展密切相关。
2.USP1对HCC患者的预后意义
为探究USP1是否可以作为HCC患者的预后标志，作者借助Kaplan-Meier绘图仪数据库评估USP1在HCC患者中的预后意义（n=364）。分析发现，USP1高表达与HCC患者低的总体存活率（OS）、无复发存活率（RFS）、无转移存活率（PFS）以及疾病特异性存活率（DSS）相关。此外，USP1高表达还与非饮酒的亚洲男性HCC患者的总体存活率差有关，但与饮酒的白人女性HCC患者则不相关。对于肝炎或非肝炎病毒感染的患者，USP1高表达预示其生存率较差。
研究结论：USP1的高表达与肝癌患者预后不良有关。
3.HCC中USP1的突变
作者利用cBioPortal数据库评估了USP1在HCC中的突变频率。研究发现，USP1在肝癌体细胞中的突变频率为0.3％，主要由错义突变组成。此突变频率相对较低，作者未能找到USP1突变与HCC患者预后之间的关系。此外，另一个数据库COSMIC显示大约44.44％的样本发生错义替换，11.11％的样本中发生同义替换，11.11％的样本中发生移码缺失。
研究结论：USP1在HCC中主要发生错义突变，但也有不少的移码缺失和同义替换。
4.USP1表达与肝癌免疫浸润的关系
作者通过TIMER数据库探究USP1表达与免疫浸润的关系。分析发现，USP1表达与所有六种免疫浸润，尤其是嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润呈显著正相关。此外，作者还分析了USP1表达与相关免疫细胞基因markers之间的相关性。与上述结果一致，USP1与几乎所有选定的免疫细胞markers都有显著正相关性。其中，排名前五的markers是GATA3，CCR8，STAT5B，BDCA-4和STAT1。
研究结论：USP1在肝癌进展中与免疫浸润过程密切相关。
5.WDR48高表达与USP1相关并预示肝癌患者预后不良
为揭示USP1的辅助因子WDR48在肝癌中的作用，作者评估了其表达和预后意义。通过分析UALCAN数据库，作者发现WDR48也在HCC中显著过表达，且其在肝癌中的表达与USP1正相关。作者还发现WDR48的高表达与HCC患者低的总体生存率和无复发生存率有关。
研究结论：WDR48的高表达与USP1有关，且往往与HCC患者较低的生存率相关。
6.肝癌中与USP1和WDR48相关的差异基因
接下来，LinkedOmics数据库被用于鉴定HCC中与USP1和WDR48相关的差异基因。基于Spearman检验，作者鉴定出了一些差异表达基因。热图展示了前50个正相关（r>0）和前50个负相关（r<0）的基因。
根据Spearman检验，作者决定选择系数>0.4的正相关基因，结果共选择了与USP1正相关的1175个基因和与WDR48正相关的199个基因。在这些基因中，有98个基因与USP1和WDR48都呈正相关，于是进一步分析这些基因。作者将98个差异表达的基因输入到STRING和Cytoscape中以构建PPI网络，并使用DAVID进行GO和KEGG富集分析。KEGG结果显示，共表达的基因主要参与细胞周期、醛固酮合成与分泌以及雌激素信号通路。
研究结论：数据分析结果显示，有98个基因的表达与USP1和WDR48都呈正相关。这些共表达的基因主要参与了细胞周期、醛固酮合成与分泌以及雌激素信号通路。
7.HCC中hub基因的鉴定及其预后价值
作者通过MCODE识别了PPI中最重要的群集，并用cytoHubba确定了前十个中心基因。GO分析结果表明，诸如染色质重塑，共价染色质修饰和染色质结合之类的生物学过程受到了显著影响。然后，在Kaplan-Meier Plotter中评估了hub基因对预后的意义。有七个基因（BPTF，SETD2，SMARCC1，UBXN7，SMC3，PBRM1和SF3B1）的高表达与较低的总生存率显著相关，而其他三个基因则未显示出显著相关性（ATRX，SIN3A和USP34）。
研究结论：在10个鉴定出的hub基因中，7个基因的高表达与较低的总生存率显著相关，而其他三个基因则无明显相关性。
8.在HCC细胞系中验证USP1和WDR48的相互作用
作者发现USP1和WDR48的蛋白质水平在MHCC97H和SK-Hep-1的HCC细胞系中都高表达。然后，作者用siRNA敲低了这些细胞系中的USP1，结果发现在MHCC97H和SK-Hep-1细胞中USP1的敲低显著降低了WDR48的水平。作者最后利用特定的USP1抑制剂ML-323进行下一步实验。经50μmol/L ML-323处理24小时后，USP1和WDR48在MHCC97H和SK-Hep-1细胞中表达水平均有下调。此外，作者用免疫共沉淀法在HCC细胞系中进行检测，结果表明USP1与WDR48有相互作用。
研究结论：HCC细胞系中USP1和WDR48之间有相互作用。USP1敲低会降低WDR48的表达水平。
9.转染SiRNA-USP1或ML-323处理可抑制HCC细胞增殖
作者在以下实验中探索了USP1在HCC细胞增殖中的作用。结果表明，USP1基因敲低可以显著抑制MHCC97H和SK-Hep-1细胞的增殖。USP1敲低后，作为USP1/WDR48的细胞靶点之一的增殖细胞核抗原（PCNA）水平显著降低。此外，USP1敲低还降低了细胞周期蛋白D1和E1的表达水平，从而通过细胞周期停滞抑制了肝细胞的生长。此外，ML-323处理也降低了PCNA，cyclinD1和cyclin E1的表达水平。
研究结论：靶向USP1可以抑制HCC细胞的增殖。
结论与讨论
在这项研究中，作者发现USP1在肝癌(HCC)中的高表达可能预示着患者的预后不良，这表明USP1可作为HCC治疗的新潜力靶点。研究发现, USP1及其辅因子WDR48通过去泛素化和稳定其底物而参与HCC的肿瘤发展，其潜在的底物基因主要富集于细胞周期、醛固酮的合成与分泌以及雌激素信号通路。进一步的研究表明，靶向USP1可以通过细胞周期停滞抑制肝癌细胞的增殖。
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原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cpr.12908
