记笔记自用1
液氮裂解细胞
小分子结合→不同梯度加热→离心取上清液→跑Western电泳→转膜→封闭→孵抗体→显隐
DNA胶制作→跑电泳→回收DNA→测浓度→同源重组
提质粒→测浓度
液氮反复冻融细胞裂解液（细胞+PBS）是最温和的裂解细胞的方式，可以用于研究蛋白质的天然结构，小分子结合等。
具体操作：1 min冻+37℃水浴融化40% 反复
这里师姐是要看小分子与蛋白质的结合对蛋白质的影响，用温度来体现。要设置对比组（不加小分子的）
目的：将已经克隆在一个载体上的基因克隆在另一个载体上。
实验思路：①设计一对引物（目的基因两端+新载体同源臂），以原载体为模板，利用该引物将目的基因从原载体上p出来，这时目的基因上两端携带了新载体的同源臂序列。②用引物将目的基因p出。（师姐前面已经做完了）③DNA电泳回收目的基因。④同源重组
加热3 min
1%（1 g / 100 mL）的DNA胶配50 mL：
1.称0.5 g AGAROSE G-10胶于锥形瓶；
2.加入50 mL的1×TAE buffer（用50×稀释好的）；
3.将锥形瓶放入微波炉，最高温度，沸腾后每30s拿出来晃一晃，反复3-4次，使溶解充分均匀；
4.锥形瓶放入60℃水冷却；⑥加入5 μL核酸红色染料(10000× Ultra GelRed)，摇匀；
5.取模具，倒入模具，放置10 min
1.常温放两分钟，拿手指上震荡，甩一下，放冰上
2.全部转移到1.5 mL离心管（这里要很多管），4℃离心 最高转速15 min
1.挑一个点摇一夜
2.离心， 4000 J 6 min
3.取质粒试剂盒（质粒试剂盒有大中小三个规格，10 mL以内mini，20 mL midi，100 mL max）
1.温柔取下梳子，在装了TAEbuffer的电泳槽中温柔剥下胶，用刀片切下不用的，存储在装有TAE的塑料袋中，4℃
2.取1 kb Ladder；10× DNA Loading buffer
3.在DNA(25 μL)中加入2 μL的10× DNA Loading buffer
4.上Ladder
5.盖盖子，连电线，设置30 min（电压没记下）
这里DNA带负电，往正极(红色)跑
按照提质粒试剂盒操作（P1混匀→P2温和混匀放置3-5 min变清亮粘稠→E3颠倒出絮状放3-5min离心取上清→上清过滤柱离心取滤液→加异丙醇→柱平衡→柱子中放入加异丙醇的混合液→离心弃滤液→吸附柱加buffer PW→离心弃废液→再离心）
跑电泳：取上清液加PAGE loading buffer→shake→95℃金属热变性10 min
开紫外→关上→切下条带放入离心管→根据Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit 试剂盒说明提纯
1.一个电泳槽跑两张胶，短槽朝里（放胶没有拍到）
2.配1 L电泳液:1L 1×Running buffer（10×Running buffer配方：432g Glycine+90.0gTris 加水3L）＋另加 10mL 10% SDS（10g/100mL 十二烷基磺酸钠）
3.加电泳液入电泳槽（内槽填满，外槽有一些就行），拔梳子
4.金属加热后的蛋白放室温冷却，震荡一下
5.上样
6.电压先低后高120V
仪器：Nano drop spectra photometer（蛋白和核酸浓度均可测）
1.用水洗三次
2.用水blank，做空白对照
3.加2 μL 质粒 测出浓度为471 ng/μL（某个比值＞2认为有RNA污染，＜1.8认为有蛋白污染，1.8-2为核酸）
4.加2 μL DNA 测出浓度为44 ng/μL
5.水洗两次
菌：载体PET28A
细胞：载体PRT5
转膜重要！看姐手法 很多细节
1.转膜液提前预冷4℃（具体什么没记下来）
2.转膜液用甲醇激活，去掉上一层下一层蓝色保护纸
3.转膜夹，黑胶白膜：白底→海绵→滤纸→膜→赶气泡→胶（分正反 右上角切角）→赶气泡→滤纸→海绵
4.转膜装置：黑对黑 白对红
5.转膜液倒入装置
6.冰块放入转膜液
7.盖盖子红对红 黑对黑
8.200mA 1h
9.之后把膜放到20 mL 5%牛奶中,摇床封闭1h（5g/100mL 用TBST溶），再之后加抗体4℃过夜孵育一夜，第二天来显隐
