项目文章丨绘制根瘤单细胞图谱，发现共生固氮新机制
苜蓿，作为全球最重要的豆科饲用作物，是奶业高质量发展的物质基础，享有“牧草之王”的美誉。最早可以追溯自2000年前，在汉武帝时，张骞出使西域，发现大宛汗血马喜食苜蓿，就将它的种子带回关内。唐朝李商隐有诗云“汉家天马出蒲梢，苜蓿榴花遍近郊” 。这些是关于苜蓿使用的最早记载，足以看出古人们对它的重视。
而如今，苜蓿类植物早已成为人们餐桌上一道别有风味的美食，美好的事物总要有好的东西去承载，苜蓿在这千年的历史长河里，无论是作为牧草还是作为餐桌美食的存在都发挥出了最大的价值。后人们通过对苜蓿的研究，给予了这类牧草更多的价值发挥空间。
2022年中国农业大学王涛教授、董江丽教授团队在 Molecular Plant 上发表了题为“Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula”的研究论文。该团队攻克了分离根瘤单细胞的技术难关，报道了以截形苜蓿为代表的不定型根瘤单细胞转录组图谱，揭示了成熟的不定型根瘤中不同转录表达模式的细胞类群，以及共生细胞类型和非共生细胞类型的分化轨迹和生物学功能，发现了共生固氮新机制：固氮细胞将氮同化为谷氨酰胺，非固氮细胞将谷氨酰胺转化为天冬酰胺供植物生长发育的新机制。本研究中 10x 单细胞转录组测序由博奥晶典提供。
研究背景
生物固氮是农业可持续发展的重要方向之一，其中，豆科植物与根瘤菌共生固氮是全球生物固氮总量贡献最大的模式。根瘤是豆科植物与根瘤菌共生固氮的场所，在这一特殊器官中发生着复杂的物质、能量、信息交流与转化。根瘤可分为定型根瘤（如大豆、百脉根等）和不定型根瘤（如苜蓿、豌豆等），其中不定型根瘤呈现为棒状，具有持续分化的顶端分生组织，空间上从远端到近端可分为不同区域，细胞类型更加复杂；然而，不定型根瘤目前尚无系统性的细胞类型分析，不同细胞类型之间的交互和关联也尚不清楚。
技术路线
研究结果
1、根瘤原生质体制备及 scRNA-seq 测定分群
研究人员首先优化了根瘤原生质体裂解和纯化的实验方案，以截形苜蓿 14 dpi的根瘤为样本，共收集获得超过 18000 个根瘤细胞用于后续单细胞转录组测序和分析。经过数据过滤，共获得 9756 个根瘤细胞 22228 个基因的表达数据。在无监督分析条件下，根瘤细胞被分为 13 个细胞类群，包括 2 类顶端分生细胞（NA1 和 NA2），侵染前细胞（PI），侵染细胞（IF），2 类固氮细胞（NF1 和 NF2），根瘤薄壁细胞（NP），2 类非侵染细胞（UiC1 和 UiC2），维管相关细胞（VA），2 类未知功能细胞（UN1 和 UN2），以及混合无定义细胞（MIX）（如图1）。
为了进一步了解这些细胞簇的特性，作者紧接着将 scRNA-seq 数据与根瘤激光捕获显微切割技术（LCM）介导的批量转录组测序（Bulk RNA-seq）数据进行比较，发现标记基因的上下调趋势一致，这些数据的一致性也表明了作者对细胞簇的注释是非常合适的（如图2）。
2、构建定型根瘤的物理细胞图
为了进一步研究这些细胞簇的物理位置，作者利用各个细胞类群特异性表达的标记基因构建 promoter:GUS 报告系统，结果均表明分生细胞 NA1 和 NA2 主要位于根瘤顶端分生区，共生类型细胞中侵染前细胞 PI 和侵染细胞 IF 主要位于侵染区，NF1 主要位于中间区和固氮区，NF2 主要位于固氮区；非共生细胞类型中薄壁细胞 NP 主要位于根瘤中央区外周尤其是顶端区域，非侵染细胞 UiC1 和 UiC2 主要镶嵌在根瘤中央区共生细胞类型之间，维管相关细胞 VA 主要位于外周呈束状环抱根瘤中央区。
3、共生和非共生细胞的连续分化轨迹重建
紧接着，为了进一步了解不同的根瘤细胞群是如何组织和相互连接的，作者进行了拟时序分析。首先使用 Monocle2 算法对共生和非共生细胞群进行了可视化分析，选取 Na2、PI、IF 和 NF1 分析共生群并指定 Na2 作为拟时间的开始。紧接着，作者采取 Monocle3 算法进行了验证，通过拟时序分析发现，共生类型细胞和非共生类型细胞分别从两类顶端分生细胞出发沿不同的轨迹分化。
4、不同黄酮类化合物的合成和代谢在共生和非共生细胞中精细区域化及功能分析
紧接着，作者对黄酮类物质合成途径关键基因、氨基酸合成及转运途径关键基因的表达模式进行分析，发现根瘤细胞高度异质，不同细胞类群可能承担着不同的生物学功能。尤其是氨基酸合成途径，氮同化产物谷氨酰胺主要在固氮细胞 NF2 中合成，而植物利用氮素主要以天冬酰胺形式储存和转运，天冬酰胺则主要在非侵染细胞 UiC2 中合成；因此，非侵染细胞分担了根瘤氮同化生产线中的重要一环。
该研究利用单细胞转录组测序揭示了不定型根瘤的细胞异质性，为解析豆科植物共生固氮的分子机制提供了重要的数据资源。
参考文献
Ye Q, Zhu F, Sun F, et al. Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula[J]. Molecular Plant, 2022, 15(12): 1852-1867.
