USP16通过去泛素化和稳定c-Myc来调节去势抵抗性前列腺癌细胞增殖

写在前面

        今天推荐的是由上海复旦大学第五人民医院泌尿外科在2021年2月5日发表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（2020IF：11.161，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是施国伟教授，研究表明USP16通过去泛素化和稳定c-Myc来调节去势抵抗性前列腺癌细胞增殖。

研究背景

        c-Myc是一种成熟的致癌基因，在包括前列腺癌在内的各种癌症的发生和发展中起着重要作用。然而，其在癌细胞中的机制在很大程度上仍然未知，是否存在靶向c-Myc的去泛素化酶也仍然难以捉摸。

摘要部分

        作者使用生物信息学分析和shRNA筛选方法来鉴定与c-Myc基因特征相关的潜在去泛素化酶。通过CCK8和集落形成试验测量细胞增殖和活力。另一方面，建立小鼠PC3细胞异种移植模型以确认USP16在体内的功能。USP16和c-Myc蛋白之间的相互作用通过免疫共沉淀和蛋白共定位分析进行评估。作者还通过免疫组化染色检测异种移植组织和临床肿瘤组织中USP16、Ki67、c-Myc的表达。此外，通过RNA测序证实了USP16和c-Myc之间的相关性。

研究内容

1.USP16与c-Myc基因特征呈正相关     

        为了探索可能调节c-Myc信号传导的潜在DUB，作者对对照和c-Myc过表达PCa细胞(GSE51384)进行了差异表达分析，揭示了310个c-Myc介导的上调基因，然后导入GSEA软件进行基因集富集分析。使用该数据集，作者在四个人类PCa数据集中筛选了与c-Myc特征正相关的泛素特异性蛋白酶(USP)。结果显示五个USP在所有数据集分析中一致被识别。接下来，作者将五种USP的shRNA转染到PC3细胞中，并通过qRT-PCR测量shRNA的敲低效率。通过蛋白质印迹对c-Myc蛋白水平的分析显示，USP16的敲低显着降低了c-Myc的丰度。总之，这些数据表明USP16与c-Myc信号通路密切相关，可能在PCa中发挥重要作用。

研究结论：USP16与c-Myc基因特征高度相关。

2.靶向USP16在体外抑制CRPC细胞增殖

        为了更好地了解USP16在体外PCa细胞中的作用，作者在两种CRPC细胞系中沉默了USP16：PC3和DU145细胞，其特征在于不依赖雄激素的生长。通过蛋白质印迹证实了USP16的敲低效率。然后使用CCK-8测定分析细胞增殖，结果显示USP16的敲低显着降低了PCa细胞中的细胞生长。集落形成分析产生了类似的结果，即USP16缺失导致细胞集落数相对于对照显着减少。一致地，作者发现USP16的异位表达主要恢复了USP16敲低细胞的增殖率。

研究结论：USP16是CRPC细胞生长所必需的。

3.USP16敲低抑制PCa肿瘤异种移植物的生长

        为了进一步阐明USP16在体内PCa细胞生长中的作用，将稳定表达shUSP16或对照shRNA的PC3细胞皮下注射到裸鼠中。8周后，处死小鼠并提取异种移植物用于进一步研究。shCON比shUSP16组肿瘤更大且重量明显更重。此外，USP16的抑制导致裸鼠的肿瘤发病延迟。异种移植组织的IHC染色分析显示，抑制USP16降低了Ki67表达，表明USP16敲低会损害PCa细胞的增殖。

研究结论：抑制USP16显着抑制了体内PCa细胞的生长。

4.USP16以去泛素化活性依赖的方式稳定c-Myc

        在之前的分析中，作者观察到USP16在PCa细胞中的恶性作用，然后作者想进一步揭示USP16发挥这种作用的潜在机制。作者发现USP16的敲低显着降低了c-Myc蛋白丰度，但不影响其mRNA水平，表明USP16对c-Myc的调节发生在转录后水平。此外，用蛋白酶体抑制剂MG132处理显着减弱了USP16敲低对c-Myc蛋白水平的影响。接下来，作者使用放线菌酮(CHX)追踪分析检查了USP16是否可以调节c-Myc的稳定性。作者发现USP16的异位表达增强了c-Myc蛋白的稳定性，而USP16敲低降低了c-Myc蛋白的半衰期。

研究结论：USP16通过泛素化-蛋白酶体途径特异性地维持c-Myc的稳定性。

5.USP16去泛素化c-Myc     

        为了探索USP16和c-Myc之间的功能联系，作者将带有Flag标签和V5标签的质粒转染到HEK293T细胞中，然后用抗Flag抗体进行免疫沉淀。发现异位表达的USP16与c-Myc显着相互作用，反之亦然。此外，当Flag-c-Myc被Flag抗体免疫沉淀时检测到USP16蛋白，当Flag-USP16在PC3细胞中免疫沉淀时也检测到c-Myc。内源性c-Myc和USP16之间的相互作用也在PC3细胞中得到证实。接下来，作者使用免疫荧光染色证实了USP16和c-Myc在PC3和DU145细胞中的共定位。总之，这些数据表明USP16与c-Myc相互作用并共同定位。

        为了确定USP16是否充当c-Myc的DUB，HEK293T细胞用编码HA-泛素和Flag-c-Myc的质粒转染，并用野生型USP16或其催化失活的突变体USP16-C205S转染，并用MG132处理。野生型USP16，而非USP16-C205S，显着降低了c-Myc的泛素化。此外，USP16的敲低显着增强了c-Myc的多泛素化。接下来，作者探究了c-Myc蛋白的哪个多泛素修饰受USP16调节。HEK293T细胞用v5-USP16和Flag-c-Myc以及不同的HA-泛素（WT、K11、K48或K63）转染。然后用抗Flag抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。结果表明，USP16显着降低了c-Myc的K48连接的泛素化。

研究结论：USP16与c-Myc共定位并相互作用，USP16使c-Myc去泛素化。

6.USP16通过c-Myc调节PCa细胞生长

        c-Myc是一种参与细胞增殖的癌蛋白，已知c-Myc的过表达可增强多种癌细胞的活力。鉴于USP16调节c-Myc的稳定性，作者检查了USP16是否通过c-Myc调节细胞生长。作者在USP16敲低的条件下破坏或过表达c-Myc。使用蛋白质印迹检测USP16和c-Myc的蛋白质水平。集落形成分析结果表明c-Myc敲低可以消除USP16敲低在细胞增殖和生长方面的影响。此外，c-Myc过表达恢复了USP16沉默细胞的增殖和集落形成能力。这些发现通过CCK-8测定进一步证实。然后作者对有无USP16敲低的PC3细胞进行RNA-Seq分析，并通过GSEA分析基因表达谱。与先前公布的数据集的筛选结果一致，Myc靶标和Myc基因特征基因集在对照组中显着丰富。总之，这些数据表明USP16主要通过稳定c-Myc来调节PCa细胞增殖。

研究结论：USP16主要通过稳定c-Myc来调节PCa细胞增殖。

7.USP16表达在前列腺癌中升高

        接下来，作者试图在临床样本中确认上述结果。作者通过IHC染色对PCa（n=70）和邻近正常组织（n=70）中的USP16表达进行了表征。正常前列腺组织的染色评分明显弱于PCa组织。此外，作者注意到USP16染色评分与Gleason染色评分显着相关，这表明USP16在PCa发展中发挥了重要作用。为了进一步评估PCa中USP16和c-Myc之间的关联，作者使用包含82个人类PCa组织的组织微阵列检测了USP16和c-Myc的表达，发现在USP16和c-Myc的染色评分之间存在正相关。

研究结论：USP16表达在前列腺癌中升高。

结论与讨论

        USP16是一种新型的c-Myc去泛素化酶。USP16的下调显著抑制了体外和体内PCa细胞的生长。USP16通过去泛素化和稳定c-Myc来调节PCa细胞增殖，使其成为治疗PCa的潜在候选药物。

Thank you!

原文链接：

https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-021-01843-8