免疫沉淀技术之Co-IP（1）

基本定义

上期我们具体介绍了免疫沉淀技术，本期将继续带大家了解一下其衍生技术—免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）。免疫沉淀相关实验方法都具有一个共同的基础，即抗原与抗体之间的特异性结合，所以Co-IP也不例外。Co-IP是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法，由于是在非变性条件下研究的，因此可以反映蛋白质在细胞内互作的真实状态。适用于研究两个已知蛋白之间的相互作用关系，也可以提供已知蛋白去寻找与之相互作用的未知蛋白。

实验原理

       在非变性条件下裂解细胞，以保留活细胞中许多蛋白-蛋白相互作用的复合物。若要研究细胞内蛋白A和蛋白B之间是否存在相互作用，可将已知的目的蛋白A作为诱饵蛋白，用蛋白A的特异性抗体对蛋白A进行免疫沉淀，如果蛋白A和B之间存在相互作用，那么B也会随之沉淀下来。然后采用western blot检测沉淀中是否含有蛋白B，如果能检测到，说明蛋白A和B之间存在相互作用；反之则不存在相互作用。

图 Co-IP 实验原理示意图

实验应用

1、  确定两种已知蛋白之间是否存在相互作用；

2、  确定两种蛋白相互作用的结合位点；

3、  探索与特定蛋白相互作用的未知蛋白；

4、  分离天然状态的蛋白复合物。

研究两个已知蛋白之间的相互作用关系时，也可以将蛋白标签与目的蛋白融合，相当于给已知蛋白贴上特定的标签，通过标签抗体进行免疫沉淀、检测沉淀复合物中标签的存在与否来反映目的蛋白之间的互作情况。这种方法非常适合用于外源性构建目的基因截短体，来研究与互作蛋白的结合位点。因为蛋白截短体可能会失去抗体的抗原表位，而无法与其抗体特异性结合，此时融合标签蛋白，就能很方便地对截短体进行标记。此外，若目的蛋白在细胞内的表达水平较低，会出现检测不到的可能，因此建议通过表达载体来过表达目的基因，以提高实验的灵敏度。

一般实验流程

1、  样本制备：离心收集细胞后，加入适量预冷的非变性细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，冰上静置15-30min，充分裂解细胞，4℃离心后取上清；

2、  诱饵蛋白抗体孵育：取少量细胞裂解的上清以备western blot分析，其余的上清液加入相应蛋白的抗体（适用于IP），置于4℃摇床孵育过夜。

3、  沉淀免疫复合物：将一定量预处理过的protein A/G琼脂糖珠加入经抗体孵育的裂解液，继续于4℃摇床孵育2-4h或过夜，离心后弃上清，保留沉淀，并将沉淀洗涤3次。最后加入适量loading buffer煮5-10min。

4、  蛋白检测：处理好样本后即可用于SDS-PAGE、western blot或质谱分析。

Co-IP的优缺点

优点

Ÿ   操作流程简单

Ÿ   得到的蛋白都是天然状态下的，经过翻译后修饰的

Ÿ   也能够捕获间接相互作用的蛋白

缺点

Ÿ   低亲和力和瞬时互作的蛋白不能被检测到

Ÿ   无法判断蛋白间是直接还是间接相互作用

Ÿ   实验前需要预测互作靶蛋白，以选用相应的抗体做检测，此法对于western blot检测有一定的风险

Ÿ   可能会出现假阳性结果，需设置严格的对照

以上我们对Co-IP实验做了基本的介绍，下一期小编进一步对Co-IP的实验结果做分析并通过文献案例给大家分享。汉恒生物可为大家提供多种蛋白标签，支持Co-IP等实验的应用，欢迎联系咨询~