从SCI文献中学会蛋白互作相关实验，史上最详细酵母双杂交实验解读！
小伙伴们大家好，在实验中需要验证蛋白质之间的相互作用时，你首先想到的是哪个实验方法呢？
脑海中有没有想到酵母双杂交这个经典的方法呢？其实很多小伙伴都知道这个实验，但是好像不太清楚实验的具体原理和操作（小编上学那会也是迷迷糊糊，似懂非懂的）。今天小编就和大家掰开揉碎讲讲酵母双杂交。
首先来讲一下原理：基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子的结构往往由两个或两个以上可以分开的，功能上相互独立的结构域（domain）构成。以GAL4为例，它包含DNA结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，使下游基因得到转录。
了解了原理我们再来看看怎么将理论转化为实践吧。
首先将称为bait（诱饵）的蛋白（即已知蛋白）构建在BD载体中，并表达BD-bait融合蛋白；将prey（猎物）蛋白（即待测蛋白）构建在AD载体上，表达AD-prey融合蛋白。如果bait和prey之间没有相互作用，那么BD和AD就不能结合，下游的报告基因也就不能被激活。这里的报告基因可以是营养缺陷等基因(最后可以通过观察酵母是否生长来看是否存在互作)。
接下来举个简单的例子，以一篇文章来实际解读一下酵母双杂吧。
这篇文章做酵母双杂是为了筛选可能与暹罗炭疽菌CAP20蛋白相互作用的候选蛋白。
1 构建诱饵质粒pGBKT7-Cap20并检测其自激活（Tip：pGBKT7是一种酵母表达载体，特别设计用于表达GAL4 DNA结合结构域（BD）与bait蛋白的融合蛋白。融合蛋白在ADH1启动子下高水平表达。为了促进体外转录，在pGBKT7的GAL4 DNA-BD的表位签之间引入T7启动子。携带pGBKT7的酵母转化效率较高）。
具体方法是将Cap20的522 bp片段克隆到质粒pGBKT7的BamHI和PstI位点之间，产生pGBKT7-Cap20，通过酶消化确认并产生大约7.3 kb和0.5 kb的条带，这两条带就是质粒的长度和克隆片段的长度。
将正确的重组质粒pGBKT7-Cap20转化到酵母双杂交系统中。选择SD/-Trp平板上直径为2 mm的酵母菌落，并使用引物J-Cap20-F和J-Cap20-R进行菌落PCR。在1%琼脂糖凝胶珠上成功检测到0.5kb条带(即上面的522bp)，表明成功构建了含有诱饵蛋白CAP20的酵母。用重组质粒pGBKT7-Cap20（此质粒编码BD+Cap20）和pGADT7（此质粒编码GAL4 AD,没有加猎物蛋白）成功转化的酵母只能在SD/-Trp/-Leu平板上生长（此平板是SD+两种缺陷氨基酸混合物，携带色氨酸和亮氨酸的酵母可以在平板上生长，而没有的话则不能生长），而不能在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长（同上）。该结果表明，在没有猎物蛋白的情况下，含有pGBKT7-Cap20的质粒不能自主激活酵母中报告基因的表达。
2 使用酵母交配筛选蛋白质CAP20的相互作用成分。培养诱饵菌株pGBKT7-Cap20。将交配的培养物在SD/-Trp/-Leu培养基上孵育用于初步筛选。
然后将菌落移至选择性SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培养基，共获得102个蓝色酵母单菌落(X-α-Gal存在时，阳性克隆会变成蓝色)。筛选文库后，从所有阳性菌落中提取猎物质粒，并用pGBKT7-Cap20将其重新转化到Y187酵母中，并重新分析相互作用特征。获得24个阳性结果，从猎物中提取的相应质粒通过NCBI/BLASTx进行测序和分析。
最终从102个阳性克隆中获得了16个不同的基因（图1）。在相应的蛋白质中，发现了cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基（PKAC1）、蛋白激酶、乙酸激酶、组氨酸酸性磷酸酶、铁还原酶样跨膜成分、疏水蛋白、糖蛋白、过敏反应诱导蛋白和一些假设蛋白。
这张图就是本篇文章的主要结果。其中：pGBKT7:P53 + pGADT7:Rec-T为阳性对照；PGBKT7 + PGADT7为阴性对照（从这个图我们就可以明显看出来，阳性对照和那16中阳性的猎物的培养皿中酵母生长良好，证明其存在相互作用，激活了下游的报告基因，而阴性对照和pGBKT+Cap20+ pGADT7则没有激活报告基因。）Tip：pGBKT7:P53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白，而pGADT7:Rec-T编码GAL4 AD的融合蛋白。
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