医学微生物学实验报告

实验名称 浓汁和粪便标本中的病原菌检测

重点思考题回顾

1.培养基的制备

1.1人工培养细菌需要提供的条件是什么? 

v 人工培养细菌，除需提供充足的营养物质外，尚需有合适的酸碱度、适宜的温度及必要的气体环境。在营养丰富、生长繁殖条件适宜时，细菌生长繁殖最为迅速。细菌种类繁多，营养需要千差万别，但其基本营养要求不外水分、无机盐类、含碳化合物和含氮化合物，个别细菌还需要生长因子等特殊物质。

1.2培养基制备的原则是什么? 

v 1、选择适宜的营养物质2、营养物质浓度及配比合适

1.3怎样检查培养基是否合格? 

v 灭菌是杀灭培养基中本身的原著菌或在空气中附着的杂菌,更好的让目标菌生长(减少杂菌消耗培养基中的营养,而且有些杂菌会抑制你目标菌的生长).一般灭完菌后将培养基放在30-37度的环境中培养一天,看其有没有长菌(液体看是否变浑浊,固体看是否长菌落),即知是否灭菌后为无菌

1.4培养基按物理形状分哪几种?各有何用途? 

v 按物理性质分1.液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。2.固体培养基:含1％～2％琼脂，用于分离培养,纯培养,保种。 3.半固体培基（琼脂高层）:含0.3％～0.5％琼脂，用于动力检测,保种。

1.5高压蒸汽灭菌法的杀菌机理是什么?

高压蒸汽灭菌原理是预真空压力蒸汽灭菌器是利用机械抽真空的方法，使灭菌 柜室内形成负压，蒸汽得以迅速穿透到物品内部进行灭菌。

细菌的分离培养

2.1为何取链球菌作为空气的卫生指标之一? 

v 环境中致病微生物数量少，需要特异的检测方法，并且多依靠指示微生物

2.2为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌? 

v 金黄色葡萄球菌在自然界广泛存在,为条件致病菌,是社区和医院感染常见的病原菌之一.随着广谱抗菌药物的广泛应用,金黄色葡萄球菌易演变成MRＧSA,MRSA 具有致病性强、致死率高的特点,一直是医院感染重点监测的对象

2.3为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害? 

v 接种前灼烧是为了保证你在接种时不会污染培养物，接种后再灼烧是防止菌种飘出，污染接种室或者超净台，影响整体接种环境，也是降低污染率的一种措施。 

2.4做细菌培养时，平板为什么要倒置? 

1.由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长

2.防止空气中微生物的污染培养基及培养物：倒置时平板内的空气是不流动的,杂菌不会沉降到培养基表面,如果不倒置,很快平板周边会长起杂菌。

3.倒置培养使琼脂里水分不易蒸发出去，而充分的保持琼脂的弹性与细菌容易繁殖和生存的环境。如果不倒置，大概3天左右培养基就会出现龟裂等水分散失的情况。. 而一些落菌等试验，需验证培养基无菌，就要先倒置培养48小时才可作为模板做落菌，水分散失是很重要的。

2.5培养细菌的常用方法有哪些? 

v 根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。

1、一般培养法：将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18－24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3－7天直至一个月才能生长。

为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。

2、二氧化碳培养法：某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，

3、厌氧培养法：常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱三种。

2.6从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项? 

首先挑取一环(接种环)生理盐水于玻片上.

再挑一点菌落(量少)

先在玻片上生理盐水附近磨菌落,把菌落都磨到玻片上,再将生理盐水拉进来,与菌落混合涂匀.如果直接放到生理盐水里,很可能菌落整块从环上脱落就不容易涂开了.

涂好后,在酒精灯火焰上来回拉几下加热固定.加热温度以不烫手背为宜.如果不固定,染片过程中菌膜容易脱落

干燥,染色

细菌的纯培养

3.1在微生物学实验中,怎样才能避免杂菌的污染? 

做实验前超净工作台紫外灯尽量开到30分钟，操作前注意器具及培养基灭菌，以及手部消毒。操作时，尽量使自己顺手，点酒精灯，在酒精灯边操作（生物安全柜内不能使用酒精灯，但有其他高温装置）。

接种时，瓶口或试管口需要在酒精灯上旋转过火，塞瓶盖时，也需要同样操作。使用金属接种环时，需要烧红，反复三次。一次性灭菌接种环则直接用，但注意包装袋的灭菌。避免瓶子或离心管长时间在超净工作台内打开，且打开过程中，除操作步骤外，尽量避免任何物品经过，包括手部。

移液枪保持洁净，不与超净工作台外枪混用。使用前使用75%酒精擦拭，必要时可塞脱脂棉。（有些移液枪可以直接灭菌）。实验结束后进行清理，打扫。最后打开紫外灯。处理实验器具及废液。

3.2空气的卫生标准规定如何? 

v 环境空气质量，是标准为贯彻《 中华人民共和国环境保护法 》和《 中华人民共和国大气污染防治法 》，保护和改善生活环境、生态环境，保障人体健康制定的标准。 标准规定了环境空气功能区分类、标准分级、污染物项目、平均时间及浓度限值、监测方法、数据统计的有效性规定及实施与监督等内容。

3.3你的实验结果说明了什么问题? 

v 细菌的种类繁多。在空气中特别是人员密集的地方容易产生较多细菌。

3.4怎样从医务人员手指上分离和鉴定金黄色葡萄球菌? 

v 将医务人员的手指按在培养皿中，培养后取菌五区划线。取出金黄色的菌落再纯化，得到金黄色葡萄球菌。

3.5菌落特征主要描述哪几方面问题？如何挑选单菌落？

细菌菌落的特征描述应当包括：菌落的大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起状态、边缘特征等。

把菌液稀释浓度低些，出现较稀少的单菌落比较好。当调取到纯的菌落，进行摇平培养，培养时间控制别太长，然后再稀释涂布分离一次。

细菌的形态学检查

4.1革兰染色法的关键步骤是什么?为什么? 

v 革兰氏染色四大基本步骤：结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色、沙黄复染，其中乙醇脱色是关键。 因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性，如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。 革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。 革兰染色法，由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。

4.2染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物? 

v 并不是说绝对需要24小时以内新鲜长出来的细菌，而是要使用处于对数生长期的细菌，在这个时期内的细菌，因为菌龄比较年轻，各种细菌的生理生化反应典型而明显，这样通过革兰氏染色才能获得正确的结果。 如果使用老龄化的细菌，那么因为细菌生理生化现象已经不典型，细胞壁也出现了变化，做革兰染色可能会出现错误。

4.3如何使用油镜?

1 使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，使载物台倾斜，以免香柏油流溢，影响观察，污染台面。 

2 对光 

  采用天然光为光源时，宜用平面反光镜；若用人工灯光时，则用凹面镜。 

  首先打开光圈，转动反光镜，使光线集中于集光器。可根据需要，上下移动集光器和缩放光圈，以获得最佳光度。 

  一般用低倍镜或高倍镜观察物象或用油镜检查不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；若用油镜检查染色标本时，光度宜强。应 将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，集光器上升至与载物台相平。 

3 调焦距： 

将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴镜油一滴，再换油镜观察。 

转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。 

然后双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。 

    观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落。

5.细菌的生化试验 

5.1细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 

（1）感染性疾病的病原学诊断：由细菌引起的感染性疾病，最确切、最可靠的诊断依据（“金标准”）是，从患者标本中将病原菌分离培养出来，并鉴定其菌属、种和型。 细菌的生化反应对菌体形态、革兰染色反应和菌落特征相同和相似的细菌的鉴定尤为重要。 细菌药物敏感试验能指导临床选用抗菌药物治疗。

（2）生物制品的制备：制备疫苗、类毒素、抗毒素等用于防治，制备菌液、抗血清等用于诊断。

5.2为什么要在发酵管液面上方大约2～3cm处切割？ 

v 当切割面太靠近液面，可能产气可经管口漏出而导致无法判断是否产气

5.3培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？ 

v 会使产气的微量发酵管的气体排出， 导致所看到的现象不准确。

5.4抗菌素敏感性实验有何实际意义? 

v药物敏感性试验是针对药物 对机体敏感的实验，在严重感染难于控制或用临床多种抗生素无效的病人才做的，当然现代提倡做药敏，以免乱用抗生素。 抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效。

5.5血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么? 

防止细菌暴露在空气中污染

5.6半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 

在操作动力实验的过程中，接种针应该要顺着原路退出，如果此过程中接种针左右摆动了，会出现本没有鞭毛的细菌经培养呈现一片浑浊，难以判断是操作有误还是细菌的运动所致。

5.7为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照? 

设置有一个没有菌落的半固体穿刺

放置一个只有三个无药物的圆纸片

设置只打开不接种的发酵管

6.细菌的血清实验

 案例分析：现在有一个病人，发热、不适、全身疼痛5天（前驱期），怀疑是伤寒沙门菌引起的肠热症，请设计一个实验，对伤寒沙门菌进行分离和鉴定。

  解析

标本的采集与病程的关系：第1周取外周血，第1-3周取骨髓液，第2周以后取粪便和尿液。 

血液和骨髓液：先增菌培养，然后再用血琼脂平板、巧克力琼脂平板、SS琼脂（黑色菌落）、EMB平板（粉红色 菌落）分离单菌落。 

粪便：可直接接种于选择鉴别培养基，如SS琼脂、EMB平板分离单菌落。 

取血量：一般以肉汤培养基的1/10为宜。常规方法为用培养基50ml,取血5～10ml,注入培养瓶中。骨髓为1～2ml。细菌的纯培养必须用纯的细菌培养物作鉴定v 

形态与染色：革兰阴性杆菌，有周鞭毛。 

动力学试验：细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态。 

生化反应：分解葡萄糖只产酸不产气 ，不发酵乳糖

血清学反应：主要有O和H两种抗原。伤寒沙门菌还有Vi抗原。对沙门菌属的型和亚型鉴定有重要意义。 

玻片凝集试验：定性鉴定细菌纯培养物。 

肥达反应：用已知伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H抗原和甲、乙型副伤寒菌H抗原与患者血清作试管凝集试验（定量），检测有无相应抗体及其效价，以辅助诊断伤寒或副伤寒。 

正常值：一般是伤寒沙门菌O抗体的凝集效价≥1：80，H抗体凝集效价≥1：160，副伤寒沙门菌H抗体凝集效价≥1：80才有诊断价值。 

动态观察：若效价逐次递增或恢复期效价比初期≥4倍者更有意义