文献学习-循环 CD34 + 祖细胞预测冠状动脉疾病人群的死亡风险
摘要
理由
低循环祖细胞(PC)数量和活性可能反映了内在的再生/修复潜能受损，但仍不确定这是否转化为更差的预后。
目标
研究在心血管疾病高危人群中，低个人电脑数量是否会增加死亡风险。
方法及结果
接受冠状动脉造影的患者在不同的时间段分为两组(1，n = 502和2，n = 403)。PC 通过流式细胞术计数为表达 CD34的 CD45med + 血液单核细胞，另外定量共表达 CD133，VEGFR2和 CXCR4的亚群。CD34细胞的变异系数分别为2.9% ，4.8% ，21.6% 和6.5% 。随访每个队列的平均时间分别为2.7年和1.2年，为全因死亡的主要终点。
在队列1中，CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞计数与死亡风险呈负相关(β = -0.92，p = 0.043和 β = -1.64，p = 0.019)在队列2中证实(β = -1.25，p = 0.020和 β = -1.81，p = 0.015)。合并队列(n = 905)的协变量调整 HR 分别为3.54(1.67-7.50)和2.46(1.18-5.13)。CD34 +/CD133 + 细胞计数改善了超出标准风险因素的风险预测指标。
结论
主要鉴定为 CD34 + 单核细胞或其表达 CD133的子集的循环 PC 计数降低与冠状动脉疾病个体的死亡风险相关，表明内源性再生能力受损与死亡率增加有关。这些发现对细胞疗法的生物学理解、风险预测和细胞选择有一定的意义。
引言
尽管心血管危险因子介导的血管内皮损伤已被很好地描述，但在发现祖细胞(PC)在血管修复中的关键作用之前，对于再生的机制知之甚少。1-3循环 PC 是单核的，主要起源于骨髓，但不仅仅起源于骨髓，具有分化成几个谱系的潜力，并且有助于血管修复和再生。来自人骨髓的1,2,4,5 CD34 + 单核细胞包括造血(CD34 +/CD45med)和非造血(间充质)祖细胞的不同谱系。6 CD34 + 细胞具有较大的心肌修复潜能。7 CD133是在成熟过程中丢失的原始干细胞的5-跨膜抗原标志物，并且表达两种标志物(CD34 +/CD133 +)的细胞可以进一步富集血管 PC 表型。虽然已经提出了额外的血管内皮生长因子受体 -2(VEGFR2)的表达来鉴定更多分化的 PC，但是与其他更丰富的 CD34 + 群体相比，这些亚群仍然难以重复定量。最后，CXCR4的共表达，其促进 PC 归巢到基质衍生因子富集的缺氧环境以增强修复，也可以进一步表征 PC 具有血管修复能力。
血液中 PC 的计数和活性较低与心血管危险因素和血管功能障碍有关，实验研究表明 PC 计数减少反映了再生潜能受损[11-15]。早期研究报道了低数量循环 PC 受试者不良心血管事件的风险增加。然而，大多数关联是由程序性终点驱动的，PC 的特征可变为 CD34 + ，CD133 + 或 CD34 +/VEGFR2双阳性细胞[16-18]。低循环 PC 计数是否增加高心血管风险受试者的死亡率尚不清楚。
我们试图全面研究 CD34 + 富集的个人电脑对冠状动脉疾病(CAD)患者的预后影响，假设低循环个人电脑计数(反映心血管再生能力降低)将与更高的死亡率相关。作为次要终点，我们还研究了 PC 与心血管死亡之间的关系以及死亡和心肌梗死的联合结果。
方法
研究人口
年龄在20-90岁之间的研究参与者被招募为埃默里心血管生物库的一部分，这是一个正在进行的前瞻性队列，患者在接受冠状动脉造影之前登记，在三个埃默里医疗保健站点调查或管理 CAD，收集关于人口特征，病史，药物使用，行为习惯和风险因素患病率的数据，其细节已经发表过
在相同的方案下收集了两个子群体，采用相同的采样策略和采集方法，但是在时间上和细胞定量方法的改变上分开(见下文)。队列1(n = 502)在2006年3月至2008年9月期间入选，而队列2(n = 403)在2008年10月至2011年2月期间收集。
招募的患者在入选时是稳定的，并进行了选择性手术，尽管使用国际标准定义的非 ST 段抬高心肌梗死稳定的患者也被纳入并分类为“急性心肌梗死”。阻塞性 CAD 被定义为主要心外膜血管 > 50% 的管腔狭窄，并计算 Gensini 评分以量化 CAD 的负担。如果患者有心脏移植、免疫抑制剂使用史、恶性肿瘤史或严重感染史，则被排除在外。这项研究符合赫尔辛基宣言，并获得机构审核委员会的艾默理大学批准，所有研究对象均提供书面知情同意。
随访和终点
随访确定全因死亡的主要终点、心血管死亡的次要终点以及全因死亡或心肌梗死的综合终点。这是通过电话访谈、图表审查以及与社会保障死亡指数和国家记录挂钩而对个人电脑数据不知情的人员进行的。死因由两名心脏病专家判定，如果意见不一致，则由第三名仲裁员判定，他们都不知道个人电脑的数据。心血管死亡被定义为由缺血性心血管原因引起的死亡(致命性心肌梗死，中风，外周动脉疾病)或由于高危患者未知但推定的心血管原因引起的猝死。医疗记录被访问或要求验证所有自我报告的事件，包括心肌梗死，再次使用标准标准定义。
流式细胞仪
经过一夜的禁食后，动脉血液通过股动脉鞘收集到 EDTA 管中，然后再进行心脏导管插入术。在4小时内制备血液样品，并与荧光染料标记的单克隆抗人小鼠抗体一起温育，以在使用流式细胞术定量之前鉴定在单核细胞上表达的表面标志物。进一步的细节在补充方法中给出。
值得注意的是，队列1的初步描述性分析显示非常少见的细胞类型计数非常低。因此，对于队列2，通过向300uL 全血中添加固定数量的计数珠和减少细胞损失的裂解-不洗涤方法来完善 PC 的计数。这种改进的定量和细胞计数随后被注意到是更高的每个子集相比，队列1。通过在具有和不具有 CD133(CD34 +/CD133 +)和 VEGFR2(CD34 +/VEGFR2和 CD34 +/CD133 +/VEGFR2 +)的共表达的 CD45med + 细胞上表达 CD34表面标记，在两个队列中鉴定推定的循环 PC)。在队列2中，还定量了另外的标记 CXCR4的共表达(如 CD34 +/CXCR4 + 和 CD34 +/CD133 +/CXCR4 +)。所有细胞群均以细胞计数/μl 报告。
统计学分析
统计分析连续变量表示为平均值(SD)或中位数(IQR) ，分类变量表示为比例(%)。在参数分析之前，细胞计数是非正态分布的并且被转换(自然对数(细胞计数 + 1))。
另外，细胞群按三分位数进行分类，以得出效应估计值，并允许对两个队列进行汇总分析。
最后，为了评估细胞计数作为生物标志物的潜力，我们在队列1中得出了优化的截断值，并在队列2中应用该阈值(作为绝对值的百分位等价物)进行验证。利用 ROC曲线(ROC)分析和尤登指数(灵敏度-(1-特异性))(补充图1)确定切点。
生存分析采用 Cox 比例风险回归模型，根据年龄和性别进行调整。在汇总队列中，进一步调整了体重指数(BMI) ，糖尿病，高血压，低密度脂蛋白(LDL) ，目前吸烟，他汀类药物使用，肾功能(gFR) ，入选时急性心肌梗死，左心室射出分率(LVEF)和 CAD 负担(Gensini 评分)。对于完全调整模型(范围0-3%)缺少的协变量数据进行估算，并与未经估算的数据进行敏感度分析，发现结果相似。Cox 模型的比例风险假设通过 Schoenfeld 残差图和正式测试(以 Schoenfeld 残差总和计算的卡方检验)进行评估，没有发现显着违反假设的情况。
PC 计数对风险预测的增量值在其加入(使用上述高 v 低分类)到具有传统风险预测因子的临床模型之前和之后进行测试。计算 C- 统计量(AUC)、无类别净重分类改善(NRI)和综合判别改善(IDI)作为风险判别指标。双侧检验 < 0.05的 P 值被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用 SAS (NC)和 SPSS 20.0(芝加哥)进行。
结果
表1显示了队列1中的502名受试者和队列2中的403名受试者的基线患者特征。平均年龄和性别分布在队列中相似(62.5岁和62.9岁; 男性64.1% 和65.5%)。总体而言，患者特征反映了冠状动脉造影时招募的典型人群，超过三分之二的患者报告高血压和高脂血症，三分之一的患者报告糖尿病。
Baseline Patient Characteristics
PC 量化的可重复性及 PC 子集间的相关性
在同一技术人员两次重复分析的队列2的20个样品中，细胞类型的变异系数为: CD34 + 2.9% ; CD34 +/CD133 + 4.8% ; CD34 +/CXCR4 + 6.5% 和 CD34 +/CD133 +/CXCR4 + 7.5% 。然而，CD34 +/VEGF2R 细胞和 CD34 +/CD133 +/VEGF2R 细胞在21.6% 和35.9% 的重复性较差。由于上述改进的枚举方法，第2组的个人电脑计数普遍较高。CD34 + 及其 CD34 +/133 + 子集在每个队列中彼此高度相关(Spearman rho = 0.92和0.87，分别为队列1和2) ，其他细胞类型之间具有更适度的相关性(补充表 I)。
PC 与人口统计学及临床特征的关系
在队列1中，较低的 CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞计数与较高的年龄，男性，肾功能受损，梗阻性 CAD 和既往心肌梗死史单独相关。较低的 CD34 +/CD133 + 细胞也与 CAD 负荷(Gensini 评分)和 PAD 病史有关。在队列2中复制了两种细胞类型与年龄，性别和肾功能之间的关联，其中较低的细胞计数与较低的 BMI，较高的 HDL (相反)和当前吸烟之间存在进一步的适度相关性(补充表 II 和 III)。
我们没有观察到任何研究的细胞类型与其他心血管危险因素如糖尿病，高血压或他汀类药物使用，左心室功能，卒中史或入选时存在或不存在急性心肌梗死之间的一致关联。
PC 人群与不良结局的关系
在总共1800人年的随访中，有71人死亡。
CD34+ and CD34+/CD133+ cells 在队列1(n = 502)中，根据年龄和性别调整的 Cox 回归分析显示，CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 计数均与全因死亡的主要终点呈负相关(分别为 p = 0.043和 p = 0.019)(表2)。当分为三分位数时，那些 CD34 + 细胞计数最低三分位数的受试者与最高三分位数组(HR 4.63(95% CI，1.59-13.5))相比，死亡风险高于4.6倍。对于 CD34 +/CD133 + 细胞计数最低三分位数(HR 3.09(95% CI，1.15-8.33))的患者，年龄和性别调整后的死亡风险增加了3倍。对于这两种细胞类型，每三分位数的效应大小都有分级增加(表2和图1)。
Survival curves adjusted for age and gender, for the primary endpoint of death by tertiles of
CD34+ (upper panel) and CD34+/133+ (lower panel) cell counts. Results are show
separately for Cohorts 1 and 2 and the combined “pooled” cohort. Colored lines represent
tertiles of PC counts (Blue=top tertile; Green=middle tertile; Red=bottom tertile). P values
for effect estimate in Cox regression model.
在队列2(n = 403)中，CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 计数和主要终点之间的年龄和性别调整的关联被复制(分别为 p = 0.019和 p = 0.015)(表3)。同样，CD34 + 细胞计数最低三分位数(HR 3.43(95% CI，1.23-9.59))和 CD34 +/CD133 + 细胞最低三分位数(HR 2.93(95% CI，1.05-8.21))与每种细胞类型的最高三分位数相比，死亡风险增加(表3)。
在905名受试者的汇总队列中，CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞最低三分位数的受试者的年龄和性别调整 HR 分别为3.87(95% CI，1.86-8.06)和3.06(95% CI，1.50-6.24) ，与最高三分位数类别的受试者相比，全因死亡的主要终点(表4)。在充分调整可能的混杂因素(年龄，性别，BMI，糖尿病，高血压，低密度脂蛋白，吸烟，GFR，他汀类药物使用，Gensini 评分，LVEF，AMI)后，这些关联分别为 CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞的 HR 为3.54(95% CI，1.67-7.50)和2.46(95% CI，1.18-5.13)(表4)。
CD34 + 和 CD34 +/CD133细胞类型之间的显着相关性也被观察到心血管死亡的次要终点和死亡/MI 组合的复合终点(表2--44)。
CD34+/CD133− (negative) cells 在 CD34 + 群体中，不表达 CD133(CD34 +/CD133 -)的细胞与队列1(p = 0.132)或队列2(p = 0.07)中的所有原因死亡风险没有关联。
VEGFR2+ cells VEGFR2在 CD34 + 或 CD34 +/CD133 + 细胞上的共表达与两个队列中的死亡率无关(数据未显示)。
CXCR4+ cells 在队列2(n = 403)中列举的 CXCR4共表达显示 CD34 +/CXCR4 + 细胞的较低计数与年龄和性别调整模型中的全因死亡风险之间的边际关联(p = 0.07)。与最高三分位数相比，CD34 +/CXCR4 + 细胞计数最低三分位数的死亡风险 HR 为2.77(95% CI，1.04-7.39)(补充表 IV)。共表达 CXCR4和 CD133(CD34 +/CD133 +/CXCR4 +)的细胞表现出与死亡风险相似的临界关联(补充表 IV)。
敏感性分析
当分别对两个队列中的年龄、性别和危险因素进行 CD34 + 细胞计数的敏感性分析时，没有相互作用(补充表 VI)。尽管在队列2和队列1中存在梗阻性 CAD 和 LV 功能的相互作用，但这两个队列之间的相互作用并不一致。具体来说，CD34 + 细胞对死亡率的影响并没有因为急性心肌梗死(PAD，卒中)的入选或存在其他缺血性疾病而改变。
风险区分度测试
为了确定 PC 作为探索性分析中生物标志物的潜力，我们使用 Youden 指数确定了 CD34 + 细胞(第37百分位)的0.737计数/μl 和 CD34 +/CD133 + 细胞(第46百分位)的0.504计数/μl 的阈值队列1中的主要终点，并试图在队列2中验证这些(补充图 I)。
在调整年龄和性别后，CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞计数低于相关阈值与死亡风险增加有关(HR 2.15(95% CI，1.16-3.97)和 HR 3.16(95% CI，1.49-6.72)) ，分别在队列1中。这些发现在队列2中完全重复，具有相似的结果，每种细胞类型的“低”值(HR 2.79(95% CI，1.31-5.96)和 HR 3.27(95% CI，1.37-7.83))的死亡风险)。在汇总队列中，与高计数相比，低 CD34 + 计数和 CD34 +/CD133 + 计数与 HR 分别为2.24(95% CI，1.37-3.66)和2.83(95% CI，1.57-5.12)相关，全面调整上述协变量。
最后，在汇总队列中，我们测试了这个阈值驱动的 PC 计数的增量值。与具有临床风险预测因子的模型相比，预测死亡的 C 统计量随着 CD34 + 细胞的添加而略有增加(Δ0.020，p = 0.07) ，但随着 CD34 +/CD133 + 细胞的添加而更显着(Δ0.028，p = 0.04)。与单独的临床模型相比，包括 CD34 +/CD133 + 细胞计数的模型的无类别 NRI 和 IDI 指标也是显着的(表5)。
讨论
在迄今为止对循环 PC 表型化的 CAD 患者进行的最大的前瞻性研究中，我们证明，以 CD34 + 单核细胞为特征的低数量的血液造血 PC 可预测全因死亡的事件风险，独立于其他风险决定因素。
其中，CD34 + 细胞和共表达 CD133的细胞似乎与不良事件最为密切相关，因此在总共超过900名受试者的两个连续队列中，与这些细胞计数的最高三分位数相比，最低的死亡风险 > 2.5倍。此外，CD34 +/CD133 + 细胞计数使用风险辨别指数增加了临床危险因素的增量预测值。
基质衍生因子 -1受体 CXCR4是 PC 归巢所必需的，并且鉴定具有更大迁移和新血管形成能力的细胞。然而，共表达 CXCR4的 CD34 + 细胞与死亡之间的关联适度且不如 CD34 + 或 CD34 +/CD133 + 群体。这可能部分是因为 CXCR4只在一个群体中被枚举。
此外，与其他研究相反，我们发现共表达 VEGFR2的 CD34 + 细胞与任一队列中的结果之间没有关联，可能是因为它们的频率非常低，测量的重复性差。相比之下，总 CD34 + 细胞和 CD34 +/CD133 + 子集的定量更实用和可重复。
减少的循环 PC 与死亡相关的机制是未知的，但基于实验数据可能代表由于内源性再生和修复能力受损而增加的风险。虽然 CD34 + 细胞是异质的，但它们富含表达内皮标记基因的细胞，并在体外和体内形成内皮结构[1,22]。此外，在选定的 CD34-细胞中缺乏促血管生成活性。在我们的研究中，血液中感兴趣的 CD34 + 细胞主要是(> 95%) CD45med + ，因此主要代表造血谱系的细胞。值得注意的是，表达被认为是早期或未成熟 PC 的 CD133 + 表位的 CD34 + 细胞比没有 CD133表位的 CD34 + 细胞更精确地反映风险，与风险无关。虽然在 CD34 +/CD133 + 细胞上 VEGFR2受体的额外表达通常被认为是定义富含内皮 PC 的子集，但这仍然是一个有争议的主题8,23-26
三个较小的研究先前已经报道了不同 PC 亚群与心血管结局之间的关联。在120名患有和不患有 CAD 的受试者中，发现 CD34 +/VEGFR2 + 细胞计数和不良事件之间仅有11个事件。这一点在一项更大规模的研究中得到了证实，这项研究主要涉及血运重建事件。最后，在富含代谢症候群的受试者中，低 CD34 + 细胞计数的受试者心血管事件更为频繁，荟萃分析证实了这一发现。这些研究通常较小，更具异质性，没有列举 CD45med + 亚群，评估主要为血运重建或住院的心血管事件，并且没有进行区分度分析。相比之下，我们的研究代表了使用流式细胞术(在采集时)和前瞻性死亡率随访的 PC 的最大队列表型。此外，我们的两个队列策略，分开的时间和方法，增加了我们的发现进一步的信心。重要的是，与以前的研究相比，我们的发现对于 CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 细胞亚群是最强的，而对于共表达 VEGFR2的细胞则不是。
我们和其他人以前已经证明，流式细胞术或细胞培养中较低的循环拥有属性计数与内皮功能障碍和确定的危险因素有关。在横断面分析中，我们证实了较低的 PC 计数与高龄和肾功能受损之间的关联。我们还发现，较高的计数与男性性别，较高的 BMI 和较低的 HDL 有关。虽然急性和慢性缺血可能影响 PC 的动员，但我们没有观察到在入学时或之前的条件如 PAD 或中风时与心肌梗死有任何关联或相互作用
我们研究的优势包括(1)大型前瞻性单中心研究设计以限制异质性，(2)使用常用的高通量技术(流式细胞术)由同一技术团队定量 PC，(3)2个队列分析策略，以及(4)选择 CD34 + 细胞亚群的探索。两个队列之间方法上的变化可能被认为是一种限制，但也是一种优势，因为这些关联在不同的测量设置下得到了充分复制。我们研究的局限性在于，我们只检查了接受血管造影的高危人群，因此我们的结论可能不适用于一般人群。缺乏对细胞功能的纵向测量或评估也限制了对 CD34 + 细胞及其对健康的长期影响可能得出的结论。最后，这种分析的观察性质并不意味着因果关系，因此需要进一步的直接影响 PC 水平的介入研究。研究表明，改善中间表型，如内皮功能与 PC 动员表明，这可能是可行的
我们的研究结果有重要的意义: (1)富含骨髓来源的造血和内皮祖细胞的 CD34 + 细胞可能代表全球再生潜力的指标，这一观点得到了在急性肺损伤，肾衰竭和中风的情况下 PC 数量较少的患者预后较差的研究结果的支持;33-35(2)这些细胞亚型的定量可用于鉴定那些具有随后事件最大风险的冠心病患者，作为增强的风险预测模型的一部分，包括人口统计学，临床特征和其他新型生物标志物; (3)此外，CD34 + 细胞也可能代表潜在的可修改的风险因素，因此是治疗干预的新靶点，目前正在积极研究的可能性;36(4) CD34 + 或 CD34 +/CD133 + 细胞计数可以同样有效地用作再生能力的“生物标志物”; 和(5)这些发现可以通过支持靶向选择和收获这些特定的 PC 亚群来影响基于细胞的治疗。
总之，我们已经证明较少的循环 PC，主要鉴定为 CD34 + 单核细胞与高心血管风险个体的死亡风险相关。CD34 + 和 CD34 +/CD133 + 子集可预测未来的不良事件，并可能代表内源性再生能力。这些发现对细胞疗法的生物学理解、风险预测和细胞选择有一定的意义。
参考
Patel RS, Li Q, Ghasemzadeh N, Eapen DJ, Moss LD, Janjua AU, Manocha P, Kassem HA, Veledar E, Samady H, Taylor WR, Zafari AM, Sperling L, Vaccarino V, Waller EK, Quyyumi AA. Circulating CD34+ progenitor cells and risk of mortality in a population with coronary artery disease. Circ Res. 2015 Jan 16;116(2):289-297. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.304187. Epub 2014 Oct 16. PMID: 25323857; PMCID: PMC4715427.
