微流控荧光共定位分析：检测蛋白质DNA互作
微流控共定位简介
本用户指南将展示如何运行基于单分子光谱学的微流控共定位研究。我们将从流动池的准备开始，并向您展示如何应用压力驱动流控技术来进行DNA检测研究。
成像室由显微镜玻璃载玻片（1mm厚度，尺寸为25×75 mm）组成，上面刻有通道（一个玻璃载玻片上最多可刻9个通道），并覆盖有矩形硼硅酸盖玻片（厚度为0.13-0.17 mm，尺寸为60×22 mm）。由于玻片的厚度，管道的连接器直接固定在显微镜玻璃载玻片上。在这个实验中，我们使用ELVEFLOW MUX液体分配阀将多种蛋白质引入流动池。利用这个装置，可以实现顺序注射的最小延迟。
硬件：
OB1流量控制器，带有0-2000 mbar的通道
1个流量传感器MFS2，范围为0-7 μL/min
套件起始包：Luer锁+1/32管道+1/32套管+定制芯片连接器
1-8个15 mL Falcon培养基储液瓶
微流控芯片
FRET显微镜用于观察
化学试剂：
20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.5
50 mM钾谷氨酸
8 mM MgCl2
4%甘油
2 mM DTT
0.1% Tween20
1 mM Trolox
蛋白质或DNA分子（根据实验需要）
微流控芯片设计
芯片的底部采用了0.13-0.17 mm的硼硅酸盖玻片。顶部玻璃（盖玻片）则是传统的显微镜玻璃载玻片。最长的通道长度为40 mm，最短的为20 mm。通道深度可以不同，在这里刻蚀了20 μm、30 μm和50 μm的通道。该芯片是在研究过程中通过玻璃刻蚀技术制造而成的。通道宽度为150 μm。在显微镜玻璃载玻片的顶部，我们钻了进样孔和出样孔。连接器是根据项目需求定制的。管道的外径为1mm。
微流控共定位快速入门指南
玻璃表面处理，预组装流动池：
1. 用漂白剂清洗流动池，并用硫代硫酸钠使漂白剂失活。
2. 注入中性化亲核素溶液，然后注入酪蛋白和/或牛血清蛋白溶液以关闭表面的间隙。
3. 对于“黏性”蛋白质，通常需要预先硅烷化处理底部玻璃载玻片。
将DNA与玻璃表面键合：
- 提示：在开始实验之前，应使用凝胶过滤法对蛋白质和DNA进行标记和纯化。可以请求扩展的方案（经典蛋白质纯化）。
4. 连接OB1压力控制器：将OB1压力控制器通过气动管连接到外部压力供应器，并通过USB线连接到计算机。有关OB1压力驱动流控器设置的详细说明，请阅读OB1用户指南。
5. 将微流控储液瓶插入OB1压力控制器出口。关于Elveflow微流控储液瓶的连接说明，请参阅特定指南（见Elveflow微流控储液瓶组装说明）。
6. 连接流量传感器到OB1进行反馈控制，并将流量传感器连接在微流控储液瓶和芯片之间用于流量测量。
7. 打开OB1电源开关。
8. 启动Elveflow软件。Elveflow智能界面的主要功能和选项在智能界面指南中有详细介绍，请参考该指南获取详细说明。
9. 按下"Add instrument"，选择OB1，设置为MK3+，如果需要设置压力通道，给仪器命名，然后按下OK保存更改。现在，你的OB1应该出现在已识别设备的列表中。
10. 首次使用需要进行OB1校准，请参考OB1用户指南。
11. 添加流量传感器：按下"Add sensor"，选择流量传感器，选择模拟或数字型，设置传感器的最大流量速率，为传感器命名，选择连接到哪个设备和通道，然后按下OK保存更改。详情请参考微流体流量传感器用户指南。
12. 添加MUX分配器：按下"Add instrument"，选择MUX分配/注射，为仪器命名，选择阀门数量（10个或12个）。
13. 将OB1连接到多路接头，然后将多路接头连接到所需的所有储液瓶。
14. 使用提供的1/32英寸外径管道将微流控储液瓶连接到MUX分配器，并在MUX分配器出口处连接一个管道。对于未使用的MUX进样口，加上一个死端阻塞器。
- 提示：使用连续的MUX进样口连接液体储液瓶和死端。MUX将按照最短路径距离切换液体。如果MUX经过一个打开的进样口，空气将进入系统。
15. 设置压力（如果需要，设置其他参数），开始将液体注入芯片。等待所有气泡从芯片中排除，并确保两种液体都在流动。
- 提示：芯片引导：首先将液体流入管道，直到液体开始滴落，然后将它们连接到芯片。
16. 使用流量传感器反馈回路以1µL/min的流速连续注入以下溶液（按顺序注入）：
a. 10 µL PBS
b. 5 µL 生物素化牛血清蛋白（0.1 mg/mL PBS）
c. 5 µL PBS
d. 5 µL Pluoronics 0.5%
e. 5 µL Neutravidin 0.2 mg/mL
f. 5 µL Casein 0.02%
g. 5 µL 20 kb DNA生物素（1 µL-0.5 ng）在PCB（19 µL）中
- 提示：PBS为磷酸盐缓冲盐溶液，PCB为PBS添加了牛血清蛋白（0.4 mg/mL）和酪蛋白（0.02%）。
17. 在室温下不流动孵育至少15分钟。
18. 重新启动连续流动，使用以下溶液：
a. 5 µL PCB
b. 5 µL Neutravidin 0.2 mg/mL
c. 5 µL Pluronics 0.5%
微流控设置成像：
19. 可以使用不同的显微镜设置，例如尼康（英国金斯顿）Eclipse Ti-E显微镜，配备ApoTirf 100X/1.49油，0.13-0.20工作距离为0.12的目物镜。
20. 我们使用了功率为150 mW的488 nm激光器、150 mW的561 nm激光器（均为Coherent Sapphire Ely, 英国）和功率为100 mW的638 nm激光器（Coherent Cube），由声光可调滤波器（Gooch and Housego, 英国）控制。
21. 每个视野大约为50 x 50 μm，通道宽度为150 μm，以观察通道中间的分子而无任何扭曲或伪像。
该项目得到了欧盟Horizon 2020研究和创新计划的资助，Marie Sklodowska-Curie授予协议编号为722433（DNARepairMan）。
原文链接：Microfluidic colocalization set-up for DNA analysis - Elveflow
