抑制泛素特异性蛋白酶14可抑制细胞增殖并与化学治疗剂协同作用于神经母细胞瘤

写在前面

        今天推荐的是由美国贝勒医学院Dan L. Duncan癌症中心在2019年4月13日发表于Molecular Cancer Therapeutics（2020IF：6.261，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Jed G. Nuchtern教授，研究表明抑制泛素特异性蛋白酶14可抑制细胞增殖并与化学治疗药物协同作用于神经母细胞瘤。

研究背景

        神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外恶性实体瘤，耐药是导致预后不良的主要原因。蛋白酶体活性升高在神经母细胞瘤的发展和对常规化疗的抵抗中起着重要作用。泛素特异性蛋白酶14 (USP14) 是与蛋白酶体调节亚基相关的三种去泛素酶之一，正在成为多种肿瘤类型的潜在治疗靶点。然而，USP14在神经母细胞瘤中的作用尚未阐明。

摘要部分

        作者发现USP14在神经母细胞瘤中的抑制作用是通过敲低或特异性抑制剂如b-AP15通过诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖。此外，b-AP15显着抑制NGP和 SH-SY5Y 异种移植小鼠模型中的神经母细胞瘤肿瘤生长。对于联合治疗，b-AP15联合常规化疗药物如阿霉素或VP -16对神经母细胞瘤产生协同抗肿瘤作用。作者的研究表明USP14是细胞活力所必需的，并且是神经母细胞瘤的新治疗靶点。此外，由于USP14在治疗神经母细胞瘤方面的强大协同作用，抑制USP14可能作为联合治疗的一种有效策略。

研究内容

1.USP14基因敲除可抑制神经母细胞瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡

        为了确定USP14在神经母细胞瘤中的作用，作者探究了神经母细胞瘤细胞系子集中的内源性USP14蛋白水平。免疫印迹分析显示USP14在所有测试的神经母细胞瘤细胞系中表达。接下来，作者使用USP14 shRNA敲低多个肿瘤细胞系，结果发现所有六种细胞系的细胞增殖抖受到抑制，而对非肿瘤细胞系HS-5和HEK293没有影响。作者随后探究了USP14敲低是否影响神经母细胞瘤细胞中的细胞周期分布。数据显示USP14表达降低对NGP和SH-SY5Y细胞的细胞周期进展几乎没有影响。

        为了进一步了解USP14敲除对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用的分子机制，作者通过western blot来检测剪切的caspase-3和PARP（细胞凋亡的指标）。作者的数据显示，在USP14敲除的IMR-32、NGP和SK-N-AS细胞中观察到高水平的caspase 3和PARP剪切带，而在USP14敲除的SH-SY5Y、LAN-6和SK-N-BE2细胞中caspase 3和PARP的剪切较少。表明USP14的抑制部分通过诱导细胞凋亡而抑制了细胞增殖。除了USP14，UCHL5和PSMD14也通过去除多聚物蛋白底物的泛素来调节真核26S蛋白酶体复合物的功能。作者研究了这些DUBs在神经母细胞增殖中的作用。作者发现，UCHL5敲除对神经母细胞瘤细胞增殖没有影响。然而，PSMD14的抑制确实导致了细胞增殖的减少。

研究结论：USP14基因敲除可抑制神经母细胞瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。

2.USP14基因敲除可抑制神经母细胞瘤细胞的锚定生长

        作者接下来进行了soft-agar测试实验，检测USP14敲除对神经母细胞瘤细胞锚定依赖性生长的影响。USP14敲除导致神经母细胞瘤细胞的锚定依赖性生长受到明显抑制。这些结果表明，USP14在神经母细胞瘤细胞增殖和肿瘤发生中起着重要作用。

研究结论：USP14基因敲除可抑制神经母细胞瘤细胞的锚定依赖性生长。

3.USP14抑制剂b-AP15抑制神经母细胞瘤细胞增殖

        为了进一步研究USP14敲除对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用，作者用b-AP15（小分子USP14去泛素酶抑制剂）在神经母细胞瘤细胞系中进行测试。细胞活力测试显示，在所有测试的细胞系中，细胞增殖以剂量依赖的方式被明显抑制。IMR-32和LAN-6细胞更敏感，而SK-N-BE2和SK-N-AS对b-AP15处理更耐药。这些结果表明，b-AP15的主要作用方式与神经母细胞瘤细胞中的MYCN状态无关。此外，b-AP15诱导了神经母细胞瘤细胞的凋亡形态学变化。另一方面，作者发现在用b-AP15处理的六个细胞系中形成的克隆明显减少。作者进一步评估了b-AP15对非肿瘤细胞活力的影响，发现HS-5和HEK-293细胞的IC50值明显高于神经母细胞。这些结果表明，USP14的抑制会抑制神经母细胞瘤细胞的增殖。

研究结论：USP14抑制剂b-AP15抑制细胞增殖，导致泛素化蛋白的积累，并诱导神经母细胞瘤的UPR。

4.抑制USP14导致泛素化蛋白的积累并诱导神经母细胞瘤的未折叠蛋白反应（UPR）     

        以前的研究表明，阻断USP14 DUB的活性会增加许多细胞类型中的细胞内泛素化蛋白。泛素化蛋白的积累启动了内质网（ER）压力，进一步导致依赖caspase的细胞凋亡。因此，作者研究了UPS14的抑制是否会导致神经母细胞瘤中泛素化蛋白的增加。在USP14敲除的NGP和SH-SY5Y细胞中检测到泛素化蛋白明显增加。与此相一致的是，在这两个用b-AP15处理的细胞中也发现泛素化蛋白的积累。另一方面，伴随着ER应激，泛素化蛋白也会诱发UPR，从而增加HSP的表达。作者发现，用sh-RNAs或b-AP15抑制USP14会导致NGP和SH-SY5Y细胞中HSP70和HSP40的表达增加。

研究结论：抑制USP14导致泛素化蛋白的积累并诱导神经母细胞瘤的未折叠蛋白反应（UPR）。

5.b-AP15与传统化疗药物对神经母细胞瘤有协同抗癌作用     

        提高当前化疗疗效和克服已建立的化疗耐药性的能力对于高危神经母细胞瘤患者至关重要。作者探究了USP14抑制剂b-AP15是否可以与阿霉素和 VP-16 对神经母细胞瘤细胞产生协同抗癌作用。如表1所示，作者发现几乎所有剂量组合对测试细胞都有协同抗肿瘤作用。事实上，对多柔比星和耐VP-16的LAN-6细胞有更强烈的协同抗癌作用。在另一个抗性细胞系SK-N-BE2中也发现了类似的结果。

        为了更深入地了解分子机制，作者用免疫印迹法检测b-AP15与多柔比星或VP-16在SK-N-BE2和LAN-6细胞中诱导的细胞凋亡。作者发现，b-AP15处理可以大大增强Dox-和VP-16诱导的细胞凋亡。作者的数据有力地证明了USP14抑制作为一种辅助治疗方案的潜力。

研究结论：b-AP15与传统化疗药物对神经母细胞瘤有协同抗癌作用。

6.USP14抑制剂b-AP15可抑制体内神经母细胞瘤的生长     

        作者的体外数据表明USP14是神经母细胞瘤生长所必需的。接下来，作者探究了USP14是否也是体内神经母细胞瘤生长所必需的。作者将具有荧光素酶表达的NGP和 SH-SY5Y细胞注射到裸鼠左肾囊中产生的原位神经母细胞瘤小鼠模型。术后两周，用生物发光成像检查肿瘤生长。携带具有相似生物发光强度的肿瘤的小鼠被随机分为两个治疗组：DMSO或b-AP15。作者发现b-AP15显着抑制肿瘤生长并导致肿瘤重量显着降低。然后，通过IHC染色结果显示b-AP15显着抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。为了进一步评估b-AP15对体内肿瘤生长的影响，作者用b-AP15处理具有相似肿瘤信号的4周术后小鼠。通过免疫印迹分析发现，b-AP15在神经母细胞瘤肿瘤中诱导细胞凋亡。

研究结论：USP14抑制通过诱导神经母细胞瘤细胞凋亡来抑制体内肿瘤生长。

7.USP14抑制剂b-AP15可抑制体内神经母细胞瘤的生长

        在许多恶性肿瘤中，USP14的过度表达被认为与肿瘤发生有关。为了验证这些观察结果并进一步探索USP14 mRNA水平与神经母细胞瘤生存期的相关性，作者使用R2基因组学分析和可视化平台分析现有数据中神经母细胞瘤队列中的USP14表达。没有发现USP14 mRNA水平与总生存期和无事件生存期有明显相关性。此外，作者发现MYCN扩增的神经母细胞瘤和MYCN未扩增的神经母细胞瘤之间没有检测到USP14 mRNA水平的明显差异。然而，与较低阶段的肿瘤相比，晚期IV期的神经母细胞瘤肿瘤的USP14 mRNA水平明显较高。有趣的是，作者发现第四阶段的USP14 mRNA水平比其他阶段的低。因此，神经母细胞瘤标本中进一步研究USP14蛋白水平与临床结果之间的关系有待进一步研究。

研究结论：USP14 mRNA水平在IV期神经母细胞瘤患者样本中较高。

结论与讨论

        作者的研究表明, USP14是神经母细胞瘤细胞增殖的一个关键调节器，抑制USP14可抑制体外和体内的肿瘤生长。此外，抑制USP14可以克服化疗抵抗，并与传统的抗肿瘤药物协同治疗神经母细胞瘤。然而，抑制USP14的协同抗肿瘤活性的确切机制还有待于继续探究。

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原文链接：https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-18-0146