攻关活细胞分析技术，CNS发表竟如此简单？
细胞实验
是最基本、最普遍的生物分析手段之一，从细胞形态、定位、生长趋势、功能及相互作用等方向提供生物学信息。自从1674年Anton van Leeuwenhoek通过基础显微镜首次观察到活细胞以来，活细胞分析技术不断更新迭代，并在生物医学界的进步和发展中发挥着举足轻重的作用。随着医药大健康成为国家战略，高校院所、生物技术公司及制药企业等研究人员均在基础生命科学领域进行更广泛和更深入的研究。
培养箱能够保证稳定的CO2和湿度等要求，确保适合的细胞培养条件，使细胞处于最佳生长状态。常规的细胞分析实验需要频繁进出细胞间，将细胞拿出培养箱用显微镜进行观察后再放回培养箱。可是存在的问题也是显而易见的：
错失细胞的动态变化：细胞的行为是动态的，细胞群体变化、结构和功能变化可能在很长的一段时间内发生。单个时间的终点检测是片面的，甚至不可靠。
脆弱的细胞，培养不易，易受干扰：如敏感的神经细胞、干细胞、原代细胞等，易受到干扰，应该尽量减少移动，避免固定和清洗步骤等，尽量维持一个稳定的生理环境。
细胞分析复杂困难：常见的各类成像分析软件，操作复杂，步骤多，甚至需要深入的专业知识。
赛多利斯推出Incucyte®实时活细胞分析系统，可以置于培养箱中直接对细胞进行实时、动态、连续的长时间监测，确保细胞免受干扰，并将细胞的“精彩故事”变成mini电影呈现出来，提供更生动、更有趣的细胞洞察。
目前有超过13000篇相关文献均使用Incucyte®系统进行细胞学研究，其中CNS顶刊超过200篇，广泛涉及肿瘤、免疫、药物开发、代谢、干细胞、再生医学、疾病感染等诸多领域，涵盖了细胞增殖、迁移/划痕/趋化、细胞毒性、凋亡、侵袭、细胞杀伤、3D肿瘤球、神经生长等多种应用。
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在此，我们甄选出五篇使用Incucyte®的高引CNS文章，详细介绍实时活细胞分析技术的典型应用。
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Science：免疫细胞杀伤
应用领域：肿瘤学
约翰霍普金斯大学的Shibin Zhou等人[1]开发出一种靶向TP53突变基因的双特异性单链抗体H2-scDb。采用Incucyte®的NucLight green快速染料标记1 × 104个TYK-nu细胞，96孔板放置4h，然后加入2 × 104个或5 × 104个T细胞和激活剂scDb（anti-CD3ε scFv，单链双特异性抗体形式）进行共培养。不断减少的绿色荧光信号，表明激活的T细胞具有显著的免疫杀伤作用。同时，通过Incucyte®系统的10×物镜连续拍摄120h，计算每孔中每mm2的gfp阳性对象数量，发现H2-scDb介导的细胞毒性同样通过TP53的破坏而减轻。
2
Nature：神经细胞吞噬及分化
应用领域：神经科学研究
中枢神经系统（CNS）损伤和疾病会强烈诱导星形胶质（Astrocytes）细胞通过增生可形成胶质“瘢痕”。斯坦福大学Shane A. Liddelow等人[2]研究发现了一种星形胶质细胞亚型（A1）。A1由激活的小胶质细胞通过分泌Il-1α、TNF和C1q诱导生产，并参与多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏症、亨廷顿氏症和帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化症和多发性硬化症。A1没有促进神经元生存、生长、突触发生和吞噬的能力，但可以诱发神经元和少突胶质细胞的死亡。当阻断A1的形成时，中枢神经系统神经元的死亡被阻止了。这为神经退行性疾病的新疗法提供机会。此研究中研究人员通过pHrodo red染料突触小体及髓鞘碎片来研究大鼠神经细胞Astrocytes对其的吞噬能力。在Incucyte®的20×物镜从24孔板中获取9张图像，检测比较吞噬能力。同时还在明场视野下监控OPCs (oligodendrocyte precursor cells)细胞的生长分化过程。
3
Nature：划痕实验及细胞迁移
应用领域：转化医学
伤口愈合涉及细胞迁移、增殖和细胞外基质重塑，以及转化生长因子-β（TGF-β）的刺激。其中角质细胞（Keratinocyte）的迁移和上皮形成对伤口愈合至关重要。新加坡国立大学Prabha Sampath等人研究发现[3]，microRNA-198 (miR-198)表达后会通过靶向和抑制DIAPH1, PLAU 以及LAMC2来抑制角质细胞迁移，而FSTLI恰好相反，能够促进角质细胞迁移。TGF-β1作为关键的转录调节开关，能够通过降低KSRP(KH型剪接调节蛋白)的产生来抑制miR-198的生成，并间接促进FSTL1的表达。这一发现为改善病人伤口愈合疗法提供新的途径。在此研究中，Incucyte®被用于划痕实验及细胞迁移的实时监测。角质细胞转染48h后，使用Incucyte® wound maker制造划痕，用Incucyte®拍照监测创伤愈合情况。上图和视频分别为不同时间点转染对照siRNA以及fstl1特异性siRNA的细胞迁移图像(n=5)。在24h时，对照转染细胞的伤口完全愈合，而敲除FSTL1后细胞的伤口仅愈合15±5%。Incucyte®监测过表达的对照miRNA角质细胞的划痕实验Incucyte®监测过表达的miR-198角质细胞的划痕实验视频来源：Sundaram, G., et al. Nature 2013, 495, 103–106
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Cell：细胞毒性及细胞凋亡
应用领域：免疫学
RIPK3（受体相互作用蛋白激酶-3）激活MLKL，导致质膜（PM）破坏和一种受调控的坏死性凋亡。St. Jude儿童研究医院的Douglas R. Green等人[4] 发现激活MLKL导致破碎的、带有暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）的PM气泡产生，这些气泡从原本完整的细胞表面释放出来。ESCRT-III机制是形成这些气泡的必要条件，当MLKL的激活受到限制或被逆转时，它能维持细胞的生存。在坏死细胞死亡的条件下，ESCRT-III控制质膜完整持续的时间。由于ESCRT-III的作用，坏死细胞可以表达趋化因子和其他调节分子，促进CD8+T细胞的抗原交叉刺激。研究人员通过将Sytox-Green标记的L929细胞死亡刺激物转染到L292细胞中，用Incucyte®监控不同时间点以及不同抑制剂的情况下的细胞死亡情况（% SytoxGreen），并确认ESCRT-III可以对抗坏死性凋亡（Necroptosis）。
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Nature：细胞增殖
应用领域：病毒学
德国BioNTech公司的Ugur Sahin等人[5]开发的BNT162b2是全球首个上市的mRNA新冠疫苗，并取得了显著的治疗效果。在该疫苗的临床前研究中，采用Incucyte®系统建立了假病毒血清抑制试验。Vero-76细胞接种于96孔板中，小鼠血清倍比稀释后与VSV-SARS-CoV-2假病毒悬液(4.8 × 103感染滴度/mL)混匀室温预孵育10分钟，然后转移到Vero-76细胞中，37℃下孵育20 h。在Incucyte®中培养，通过4×物镜并进行明场全孔扫描和GFP荧光扫描。计算pVNT50（与无血清假病毒阳性对照相比，可减少每孔50%GFP阳性感染细胞数的最低血清稀释度）来评价疫苗血清的病毒抑制能力。
Incucyte®实时活细胞成像分析为以上的细胞学实验开展和数据分析提供了高效便捷的工具。2020年，Science副刊《Science Immunology》还曾专门发布独家文章，对Incucyte®的相关应用进行聚焦和分析。
Nature 子刊，攻坚实体瘤，CAR-T疗法寻突破
2021年顶级医学期刊nature medicine发布了CAR-T之父Carl June最新研究，也是首个CAR-T治疗实体瘤临床研究结果。CAR-T细胞疗法治疗实体瘤不再是停留在理论与展望阶段，而是进入了前列腺癌治疗的Ⅰ期临床研究，并且证实了抗TGF-β的CAR-T细胞疗法治疗转移性去势抵抗性前列腺癌这一实体瘤是安全可行的。
我们看到了CAR-T细胞疗法治疗实体瘤取得的重大突破，但举步维艰的过去同样值得铭记和反思。实体瘤本身及其微环境的特殊性为细胞治疗带来了巨大挑战，一方面，实体瘤细胞抗原的异质性以及特异性肿瘤抗原的缺乏使CAR细胞难以对肿瘤细胞进行精准的靶向性识别和杀伤；另一方面，实体瘤特殊的肿瘤微环境，包括异常血管结构和基质成分组成的第一道物理屏障，以及TME 中多种免疫抑制细胞、抑制性免疫及代谢分子组成的二次屏障，使得细胞治疗药物难以浸润肿瘤组织。但随着对肿瘤生物学和免疫学的进一步研究，科学家开发了一些应对策略克服这些障碍，使得细胞疗法应用于实体瘤成为可能。2023年3月23日14:00-15:30药融圈联合赛多利斯举办本次线上研讨会，邀请2位行业专家，就细胞治疗在实体瘤治疗方面的新技术、新思想展开分享，欢迎观看。
