深度长文 | 剖析单细胞文章的谋篇布局

目 录

基础信息

内容概述

阴茎海绵体（CC）是阴茎勃起最重要的结构，其功能障碍（ED）引起患者及其家庭的许多生理、心理问题。然而，由于伦理、舆论等方面的禁忌，以及获取样本的途径有限，对阴茎海绵体的细胞异质性和分子水平的细胞通讯网络研究甚少。本研究作者通过分析来自3名勃起正常的男性和5名器质性勃起功能障碍患者（其中包括2名糖尿病性勃起功能障碍(DMED)患者）的64993个人阴茎海绵体单细胞转录组数据，同时结合RNAs-seq，qPCR以及免疫组化染色等细胞功能学实验，揭示了人类阴茎海绵体的单细胞图谱和细胞异质性，阐述了人类阴茎海绵体组织的细胞微环境，为潜在的勃起功能障碍治疗提供了理论参考。

研究思路

本研究仍然是经典的“总-分”结构：先总体概况项目实验方案、细胞组成、特征基因等内容，再逐步转入到针对各个研究对象的精细亚群分析和功能验证。再加上本研究将单细胞数据分析与细胞功能实验有机结合起来，进一步增强了单细胞分析结论的可信度及其临床生物学意义，可以称得上一篇结构工整，细节处处体现新意的单细胞文章范本，非常值得大家参考与借鉴。

研究内容一：项目数据概况

图1a采用卡通流程图的形式总结了项目的整体实验方案设计，图1b以聚类图的形式展示了64993个单细胞数据的细胞组成和样本来源。随后作者分别以特征图（图1c）和热图及GO注释（图1d）的方式，展示了阴茎海绵体样本中，各个细胞类型的特征基因及其相关的生物学过程。经过卡通流程图+聚类图+特征图+热图的经典组合，作者分层次有条理地向大家描绘了人的阴茎海绵体样本的单细胞数据概况。

编者心得一：分析对象的选择原则

如前所述，在图1中已经对阴茎海绵体样本中的细胞组成比例，样本来源以及特征基因表达，有了初步的认识。总体概况做好了，那接下来的关键问题就是：我该选择哪种细胞类型作为研究对象，进行细致的分析和研究？有的读者当然会说，小孩子才做选择，成年人当然是我全都要！

其实即使是数据中的每一种细胞类型都要做细致的分析，在开展分析和结果展示的时候，也是有先有后、详略得当的。下面为大家奉上编者呕血总结出来的黄金原则：

💠 原则1：基于研究兴趣/研究领域，选择主观上最感兴趣的细胞类型

过去研究者一直认为阴茎海绵体仅仅属于一种特化的血管结构，但阴茎海绵体中的血管内皮细胞（EC）的具体分类及其特征基因表达、内皮细胞与其他细胞的互作、内皮细胞发生了哪些改变导致了ED患者的表型等等这些问题，并没有得到深入而细致地研究。并且在这套数据的所有的细胞之中，有接近40%的细胞是血管内皮细胞。因此根据作者的研究背景，主观上最感兴趣的细胞类型当然要属血管内皮细胞（EC）。随后作者也在用了图5和图6两张图的篇幅，来集中讨论血管内皮细胞（EC）表型与功能。

💠 原则2：基于客观分析的细胞组成：选择细胞数变化最显著的细胞类型

除了根据主观兴趣之外，还可以根据数据分析的客观结果，选择分析对象。例如根据图1b的结果，来自 ED患者的样品中的平滑肌细胞（SMC）数目显著高于来自正常人样本的SMC细胞数。同时考虑到平滑肌细胞的收缩与舒张，可以通过控制阴茎的血流量进而而影响勃起状态。综合考虑以上信息，平滑肌细胞（SMC）的数目变化及其细胞生物学功能可能与ED患者临床表型的发生和进展有比较强的相关性。随后作者也在图4中研究了平滑肌细胞（SMC）的精细亚群及其特征表达基因，以及与平滑肌收缩/舒张的关键基因与信号通路。

💠 原则3：基于客观分析的基因表达：选择细胞通讯最频繁的细胞类型

除了定量比较不同组别间的细胞数目多少，还可以在基因表达的分子生物学层面去寻找值得深入研究的目的细胞类型。例如作者别出心裁地利用图1e，展示了阴茎海绵体组织的细胞通讯网络中，各种细胞类型发出/接收信号的频度。可以看出成纤维细胞（FB）具有最强的发出信号，同时又几乎没有接收信号，因此推测成纤维细胞（FB）在整个细胞通讯网络中，处于的发号施令的核心状态。因此作者认为，深入研究成纤维细胞（FB）的精细亚群及其在细胞通讯过程中的生物学功能，极有可能有助于解析ED患者的临床发病机制。随后作者也利用图2和图3，详细阐述了成纤维细胞（FB）的精细亚群及其特征基因，以及成纤维细胞（FB）参与的细胞通讯网络。图1e，虽然只占据了左下角非常小的篇幅，却很好的起到了承前启后的作用，将项目总括的图1与随后精细亚群分析内容自然地串联起来。这种通过细胞通讯最频繁的依据来选择分析对象的方式比较有新意，非常值得读者参考。

研究内容二：细胞通讯网络的分析与验证

前文提到细胞通讯网络的分析结果显示成纤维细胞（FB）显示最强大的信号输出能力，表明FBs是调控微环境稳态的关键。出乎意料的是，MAC、SWC和T集群表现出典型的信号接收模式。在这些信号相互作用中，作者发现了许多经典的血管组织调节途径，如VEGF、IGF、NOTCH等。并进一步鉴定了KIT(SCF受体)、FGF、EGF等正常与ED病理状态下表现出差异表达模式的信号。为了进一步验证细胞通讯的分析结果，作者还设计了RNA-seq、ICC和ELISA等一系列实验。。如补充图3a与3c分别展示了FB的RNA-seq和ICC结果，证明CellChat预测的大多数配体（TGFβ、CXCL12、FGFs、）在体外均在FB中表达。与此同时，补充图3b展示了内皮细胞（EC）的RNA-seq结果，证明了与之对应的受体蛋白在EC中表达。补充图3d中的ELISA结果显示，EC培养消耗了部分配体分子，FB培养增大了大部分因子的浓度。以上一系列实验结果都证实了CellChat的预测的特定细胞类型中的关键配体-受体的表达模式。随后作者评估了这些信号配体对EC功能的影响，结果是IGF1和SCF信号对CC组织修复相关功能具有正向调节作用，IGF1、SCF、FGF7和HBEGF信号有利于平滑肌舒张调节功能，而高浓度的AGEs和TGFβ则对这些功能不利。这些信号网络的结果有助于进一步理解海绵体微环境的生理和病理过程。

编者心得二：细胞通讯分析的验证实验

细胞通讯网络分析，属于单细胞数据的关联性分析。如果以身边发生的事情举例子，最近你如果正考虑买房/租房，那大概率会被各种房屋中介销售打来的询问电话折磨的苦不堪言。如果你家有小孩子，那很可能会遭受到各种教育培训机构推销电话的轮番轰炸。因此如果归纳出房屋中介销售/教育培训机构频繁联系的群体，那这个群体极有可能是对应的受众群体。

细胞通讯网络分析做的正是这样的工作：相当于将某个区域内所有细胞（人）的通话记录加以归类和统计，并通过整个通讯网络，总结出信息流的来龙去脉与层级结构，并进而根据各种通讯的属性/功能来推断不同细胞（人）群体之间发生的互动。

细胞通讯分析虽好，仍然属于一种推断分析，即根据配体-受体表达分布和细胞类型来推断可能的生物学关联。因此严谨而系统的细胞功能学实验是越来越得到重视的验证手段。如何设计验证实验，作者在文章中做出了很好的示范，下面奉上编者总结归纳的细胞通讯分析的验证实验：

💠 验证方法1：检测配体/受体的mRNA表达水平

因为单细胞测序通常检测的是mRNA表达水平，因此利用RNA-seq或者qPCR来验证对应的细胞类型中，是否表达了大量的配体或受体的mRNA分子，也是十分合理的。并且由于都是检测mRNA的表达水平，验证结果有更大可能与单细胞测序的分析结果取得一致。

💠 验证方法2：检测配体/受体的蛋白表达水平

也可以考虑用抗原特异性的抗体，通过免疫组化染色（IHC）、免疫荧光染色（ICC）或者流式细胞术（FACS）等技术手段，检测对应的细胞类型中，是否有高水平的配体或受体蛋白分子。但由于mRNA转录组与蛋白组的表达往往具有不一致性，也存在无法得到一致的验证结果的风险。

💠 验证方法3：检测配体/受体的功能性吸收与释放

前两种方法都是检测目的mRNA或目的蛋白表达的有无或高低，属于静态的检测。而如果提取对应的细胞进行培养，并用ELISA检测培养上清中，是否对应的配体蛋白浓度由于新释放或者被吸收发生了动态改变，则是一种更可信的验证手段。这篇文章的作者就利用了这个方法，成功验证了成纤维细胞（FB）释放相关配体以及血管内皮细胞（EC）吸收相关配体的现象。