如何拿下国自然新热点拟素化修饰？看这篇29分文章的研究思路！

Hello!小薇带着国自然新热点拟素化修饰（Neddylation）来喽！拟素化修饰是近年来发现的新型蛋白质翻译后修饰，可以广泛地调节生物学过程。Cell metabolism上发表的这篇最新研究中，研究者详解拟素化修饰调控葡萄糖代谢稳态的新机制。那么我们要如何get这个新热点？今天小薇就带大家一起了解这些问题，一起探索这篇文章研究内容及思路。 文献详情：

l 题目：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1的拟素化控制葡萄糖代谢 l 杂志：Cell metabolism l 影响因子：IF=29 l 发表时间：2023年7月

研究背景

葡萄糖是细胞能量的主要来源。在禁食期间，肝脏通过动员内部营养储存和非碳水化合物前体从头产生葡萄糖（糖异生），在维持葡萄糖稳态中起着关键作用。这些生理代谢重编程支持身体能量需求，而这种重编程的改变会导致不同病理条件下葡萄糖稳态的异常，如癌症和糖尿病。 拟素化（Neddylation）是近年来发现的一种类似泛素化的蛋白质翻译后修饰过程，涉及一个三步的酶促过程，可以通过多种方式调节蛋白质的活性。但泛素化的作用仍然很大程度上未知。 研究思路

在本篇文章中，作者首先在小鼠体内验证肝拟素化作用受到营养物质利用率的调节。接着作者在小鼠中使用四种拟素化损伤模型，发现拟素化在肝脏维持葡萄糖生产中发挥着重要作用。进一步，作者在四种模型中发现拟素化缺乏均显著降低了激素治疗的高血糖效应，并评估了拟素化作用的中断是否会导致胰岛素抵抗。同时作者评估了肥胖、血糖正常或T2D正常的成人（男性和女性）肝脏中的拟素化水平。接着作者通过蛋白质组，鉴定出糖异生的关键限制酶PCK1，并进一步揭示PCK1在K278、K342和K387残基中的拟素化是其体内、外糖异生活性所必需的。（ps有问题找小薇，关注小薇，科研热点、国际前沿or创新型思路，想看啥call下小薇，咱就是说安排！） 主要结果

01肝拟素化作用受到营养物质利用率的调节

首先作者使用禁食24小时的小鼠，发现NAE1、NEDD8和拟素化的肝cullins（一个由NEDD8拟素化的蛋白家族）的蛋白水平增加；再喂养后下降（图1A）。进一步观察到糖食组和瘦素治疗组中禁食诱导的肝脏NAE1、NEDD8和拟素化cullins的蛋白水平的的升高被减弱（图1B,1C）。与此相一致的是，缺乏瘦素受体的小鼠（db/db小鼠）显示NEDD8和拟素化的cullins水平升高（图1D）。这些数据表明，肝脏拟素化水平通过瘦素受体依赖的机制，因营养缺乏而增加的。

02抑制肝拟素化可以减少葡萄糖的产生

作者在小鼠中使用了四种拟素化损伤模型。与对照组小鼠相比，四种动物模型显示血糖水平较低，直接反映了糖异生受损（图1F-1I）。禁食24小时后，所有模型的小鼠的血糖水平都下降（图1J-1M）。当接受热量限制（caloric restriction，CR）时，这些模型都没有一个能够维持与对照组小鼠相同的血糖水平（图1N-1Q）。与此一致，与对照组相比，禁食（图1R）和热量限制（图1S）肝脏Nae1敲低小鼠的肝葡萄糖生成（hepatic glucose production，HGP）降低。总之，这些发现表明，拟素化在肝脏维持葡萄糖生产中发挥着重要作用。

图1 拟素化在缺乏营养时被激活，是维持血糖水平的必要条件 

03 肝拟素化调节胰高血糖素、肾上腺素和糖皮质激素的糖异生作用

在四种模型中，拟素化缺乏均显著降低了激素治疗的高血糖效应（图2）。因此，拟素化介导了葡萄糖反调节激素的作用，并且是HGP所必需的。

图2 拟素化是反调节激素的糖异生作用所必需的

04肝拟素化与胰岛素抵抗相关l

作者用高脂肪饮食（HFD）喂养小鼠短期（4天），损害肝脏胰岛素敏感性，刺激了HGP。在所有四种拟素化抑制条件下（如药理或遗传），小鼠在HFD治疗4天后PTT期间显示葡萄糖水平降低（图3A-3D）。这些结果表明，阻断拟素化可以改善HFD诱导的糖异生。接下来，作者通过在小鼠肝脏（livNAE1小鼠）中过表达NAE1（AAV-DIO-NAE1）进行了功能获得实验。这些小鼠与对照组小鼠的体重相同，但丙酮酸转化为葡萄糖的能力增加，而葡萄糖耐量或胰岛素敏感性没有变化（图3E-3J）。此外，livNAE1小鼠在禁食24小时期间（图3K）和急性胰岛素治疗后（图3L）也表现出高于对照组小鼠的血糖水平，这表明肝脏中拟素化的激活有利于HGP，并排除了胰岛素的降血糖作用。

图3 抑制拟素化可降低高脂肪饮食诱导的葡萄糖水平

05 2型糖尿病患者肝脏拟素化增加

作者评估了血糖正常肥胖或T2D的患者（男性和女性）肝脏中的拟素化水平。数据显示，与正常血糖肥胖患者相比，T2D组NAE1、NEDD8和拟素化cullins蛋白水平升高（图4A），以及NAE1和NEDD8蛋白水平与空腹血糖水平和口服葡萄糖耐量率呈正相关（图4B和4C）。因此，这些发现表明，肝拟素化的变化与肥胖和T2D患者的高血糖有关。当按性别，数据显示，与肥胖和血糖正常的肥胖女性和男性相比，肥胖和T2D的女性和男性肝脏中NAE1蛋白水平同样增加（图4D），拟素化的cullins和NEDD8的蛋白水平均有所升高（图4D和4E）。

图4 T2D患者的肝脏中拟素化水平升高

06 糖异生的关键限制酶PCK1在营养缺乏时被拟素化

接着，作者使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析方法分离了不同亚组的肝拟素化蛋白质组（图5A）。在210个拟素化蛋白中，只有61个在CR后拟素化水平存在显著差异。功能富集分析显示，糖异生的比例过多（图5B）；例如，糖异生的关键限制酶PCK1。与自由喂食的对照组小鼠相比，PCK1在CR喂养的小鼠中富集。同时作者通过免疫沉淀发现肝脏中PCK1。这些实验表明，在营养缺乏条件下，NEDD8与PCK1的共沉淀水平升高（图5C和5D）。PCK1在营养剥夺时拟素化，PCK1和NAE1之间通过免疫共沉淀发现PCK1和NAE1在这些条件下更相关（图5E和5F）。然后，作者进行了LC-MS/MS分析。通过PCK1肽谱分析发现，三个PCK1赖氨酸在禁食条件下可能被拟素化：K278、K342和K387（图5G）。

图5 PCK1在热量限制和禁食后在三个赖氨酸中被拟素化

07 PCK1在K278、K342和K387残基中的拟素化是其体内、外糖异生活性所必需的

最后，为了深入了解PCK1拟素化的功能后果，作者将肝细胞在没有营养物质的培养基中培养，然后沉默NAE1和NEDD8。禁食细胞的PCK1活性增加；相反，NAE1和NEDD8抑制阻断了禁食诱导的PCK1活性，同时培养基中的葡萄糖水平降低（图6A-6C）。这些结果也在体内得到了证实。根据这些发现以及蛋白质组学和建模，发现同时突变PCK1的三个赖氨酸残基（如K278、K342和K387）或单独突变K387会降低培养基中的PCK1的活性和葡萄糖水平（图6d和6E）。同样，通过过表达WT PCK1，而不能通过过表达三个PCK1突变体或单一（K387R）PCK1突变体来恢复活性和葡萄糖生产（图6D和6E），突出了PCK1赖氨酸残基的拟素化对PCK1糖异生功能的相关性。PCK1的沉默降低了培养基中PCK1的蛋白水平和活性以及葡萄糖的释放。PCK1-WT的补充恢复了PCK1的蛋白水平和活性，并持续增加了培养基中的葡萄糖分泌（图6G-6I）。三突变体或单突变体的PCK1（K387R）均不能恢复PCK1的活性或葡萄糖水平（图6J-6O）。同时，作者在小鼠体内进一步证实结果。

图6 拟素化的PCK1是体外糖异生功能所需要的

文章小结 上述研究中，作者描述了拟素化PCK1三个关键赖氨酸残基在葡萄糖稳态发挥生理作用，整体逻辑清晰、环环相扣！并结合组学分析探索潜在新靶标及应用价值。该文章对于拟素化的研究思路和实验设计提供一个方向。感兴趣的小伙伴们快来看看吧！ 小薇有话说

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