西北农林科技大学生命学院生物化学复习指南第5章 蛋白质分离与纯化
第5章 蛋白质分离与纯化
一、简答
1.简述离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤、疏水层析分离的原理及样品洗脱方法？
答：（1）离子交换层析：是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。
洗脱方法：蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析住中洗脱出来。层析洗脱，可以采用保持洗脱液成分一直不变的方法，也可以采用改变洗脱的盐浓度或和pH的方式洗脱。
（2）亲和层析：是把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面的功能基上。
洗脱方法：当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上而其他的蛋白质（称杂蛋白）则因对该配体无特意的结合部位而不被吸附，他们通过洗涤即可除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。
（3）凝胶过滤：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶柱层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子不能同程度的自由出入凝胶珠内外，这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到的分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
（4）疏水层析分离：就是根据蛋白质表面的疏水性差别，在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。
洗脱方法：由于疏水作用层析要求盐析化合物如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子的疏水区域暴露。为使吸附达到最大，可将蛋白质样品的pH调至等电点附近。一旦蛋白质吸附于固定相，则可利用多种方式进行选择洗脱，包括使用逐渐降低离子强度或增加pH的洗脱液（增加蛋白质的亲水性），或使用对固定相的亲和力比对蛋白质更强的置换剂进行置换洗脱。
测定蛋白质分子量方法有哪些，列举3种？
渗透压法测定分子量；沉降分析法测定分子量；凝胶过滤法测定分子量
化学组成法， 凝胶过滤法， SDS-PAGE法
1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.凝胶过滤 3.质谱----质谱是目前最为精确的分子量测定方法。
首先将蛋白质变成高速带电离子流，然后蛋白离子在真空电场中运动，在重力作用下偏转，蛋白离子在电场中偏转的距离与其分子量成比例关系。在质谱分析方法中，蛋白质分子的离子化是关键的技术。
什么是蛋白质组，研究蛋白组常用的方法是什么。
某一组合细胞表达的全部蛋白---蛋白质组
双向电泳
质谱
蛋白质芯片
酵母双杂交
常用的蛋白质沉淀方法有哪些（列三种）。
1.盐析法：加入高浓度的中性盐（如[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀
2.金属盐沉淀法：当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀
3.有机溶剂沉淀法：可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。
4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。
5.加热变性沉淀
列举三种测定蛋白质含量的方法。
1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.Flin-酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法 6.胶体全测定法
