DiBAC4(3)（双(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛尔）

DiBAC4(3)  是一种缓慢响应的电位敏感型荧光探针,DiBAC4(3)  可以进入去极化细胞，并与胞内的蛋白或膜进行结合，发出增强的荧光和红色光谱迁移。荧光波长：λex=490 nm，λem=505 nm)。DiBAC4(3) 增强去极化效果，可增加阴离子染料通量进而提升荧光强度。而超极化则表现为荧光强度下降。

DiBAC4(3) 使用方法：

可以使用DMSO、无水乙醇和纯水溶解，用DMSO溶解成10mM的母液储存，如果低浓度也可以满足要求也可用纯水溶解。

一、 用荧光显微镜测定膜电位的方法

（a）试剂

※ DiBAC4(3)

※ Dulbecco’s MEM (DMEM)

※ FBS (fetal bovine serum)

（b）方法

1) 将消化好的细胞移至DMEM中。

2) 加入FBS，控制浓度范围在：2～15% 。

3) 加入DiBAC4(3)，控制浓度范围在：1～5 µmol/L。

4) 用荧光显微镜观察刺激后荧光强度的变化。[Ar激光(488 nm) 的激光共聚焦显微镜]，由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变，所以必须在37℃的条件下测定。由于细胞膜的电位会变化，可以观察细胞质内的荧光强度变化。 

二. 用酶标仪测定膜电位的方法

（a）试剂

※ DiBAC4(3)

检测用缓冲液 (pH7.4; 20 mmol/L HEPES, 120 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 2 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2,5 mmol/L glucose

（b）方法

1) 培养细胞：在微孔板中培养细胞

2) 清洗细胞：用含5 µmol/L DiBAC4(3) 的检测用缓冲液200 µL，清洗微孔板中培养的细胞2次

3) 染色：在孔板中加入180 µL含5 µmol/L DiBAC4(3) 的检测用缓冲液，在5%CO2，37℃培养箱中孵育30分钟。

4) 测定：用荧光酶标仪观察刺激后荧光强度的变化。由于DiBAC4(3)的荧光会随温度变化而改变，所以必须在37℃的条件下测定，加入20 µL含DiBAC4(3) 的检测用缓冲液，每隔30秒测定1次荧光变化。 

三. 膜电位的标准曲线

（a）原理

膜电位变化时色素的分布也随之变化，所以荧光和吸收也会变化。这种变化程度取决于色素的分子数和细胞数的比率、色素的浓度以及细胞的种类。膜电位的标准曲线是通过用电极直接测定目的细胞的膜电位，在该电位所测得的荧光和吸收强度而制得的。 

（b）试剂

※ DiBAC4(3)

※ Eagle-Dulbecco medium

※ PBS

 c）方法

1) 用Eagle-Dulbecco medium培养细胞。

2) 取PBS中的细胞在37℃的CO2培养箱中孵育30～60分钟，然后改变孵育时间，制备不一样的CO2浓度的样品。

3) 加入DiBAC4(3)，终浓度为2 µmol/L。

4) 20分钟后，在517 nm测定各个浓度的荧光强度，并用电极直接测定此时的电位差。

5) 用荧光强度和对应的电位差来制作标准曲线。 

6) 其他方法

有钾扩散电位和荧光或吸收强度比较的方法。缬氨霉素引起钾扩散电位，钾扩散电位 (V) 是按照Nernst 方程计算如下：

V= -RT／F log[K+]in／[K+]out = -59 log[K+]in／[K+]out (mV) 

所以在缬氨霉素存在时，通过改变细胞外钾离子浓度和细胞内钾离子浓度，计算扩散电位，测定各个电位的荧光或吸收强度，比较后可以得到标准曲线。