本文介绍了应用鲎试剂（LAL）或重组C因子（rFC）进行细菌内毒素检测（BET）的分析标准，用于药物和医疗器械提取物等水溶液中内毒素的生物活性测定。它解释了这些标准对准确分析的重要性，从而可以推动更健全的BET，保护患者免受内毒素的影响。

部分凝胶法鲎试验中，BET是纯定量的，也就是说，内毒素的活性以内毒素单位EU表示，也可表示为国际单位IU。由于对液体进行分析，通常将内毒素的活性转换为浓度（如EU/mL），进而转换为其他测量单位（如EU/mg）。不同的BET方法遵循a）药典标准和b）由试剂制造商制定的试验标准；旨在保证更健全的测试性能标准。

药典标准

统一的BET章节（USP <85>，欧洲药典2.6.14.，日本药典4.01）和即将发布使用rFC的BET章节（欧洲药典2.6.32）涉及相关限（线性）、回收率（准确度）和阴性对照。在定量BET中，内毒素活性与信号输出之间存在明显的相关性。从0到无穷大EU/mL的整个范围可以用一个乙状模型来描述，如四参数逻辑回归（4PL；图1）。

如果范围受到限制，则可以通过信号输出对数和内毒素活性之间的线性回归来拟合数据，并有可能通过先前的信号消隐来向下扩展。根据标准曲线的所需范围，可以使用任何一种回归模型。根据标准曲线的所需范围，可以使用任一回归模型。另一方面，与标准曲线点相同参数的多项式模型呈现过拟合，也就是说，它强制曲线通过点而不考虑潜在关系。因此，在移液和测量中可能发生的随机误差没有得到补偿。

如果标准曲线穿过所有标准点，则存在完全相关，返回为相关系数的绝对值|r|是1。然而，系统误差（例如不完全遵循线性回归的相关性和随机误差）通常会导致偏离这种完美相关性，由较低的|r|表示。这反过来会导致BET准确性降低。因此，|r|的下限设定为 0.980。由于标准曲线是计算所有内毒素浓度的基础，因此其可靠性至关重要。

药典中提到的第二个数值限制也旨在确保高准确性。鉴于许多化合物会干扰BET（即增强/抑制测定，从而扭曲测量的内毒素活性），因此使用阳性产品对照（PPC）。它们代表掺入规定量内毒素的样品溶液的等分试样，通常是为了在接近测量范围中心的地方实现内毒素活性。未加标样品中PPC中因相应活性而降低的内毒素活性必须在加标预期活性的50%至200%以内。稀释是从干扰样品中获得这种有效加标回收率的最常见方法。尽管如此，还有许多其他方法可以克服干扰，例如pH中和、过滤、离心、提取、内毒素固定化，加热和补充镁、Tris-HCl缓冲液或螯合剂。

与上述线性和准确度标准相比，阴性对照品的限度只作了模糊的描述：它不得超过试剂制造商所描述的空白限度。这意味着空白必须在试剂制造商设定的范围内返回信号输出。根据试剂、仪器和目标信号输出的不同，这些限制可能会有很大差异；也就是说，在信号输出水平上没有任何普遍适用的数值标准。充其量可以定义为，内毒素最低标准的内毒素活性一定不能达到或超过空白。然而，这不会揭示同样影响标准和空白的污染，例如，在试剂被污染的情况下，污染的活性同样被添加到所有其他污染中。

与测试相关的标准

除药典标准外，BET试剂制造商还实施了一些标准，以确保内毒素活性测定的准确性。

每个标准品、样品、PPC和空白至少一式两份进行分析，并报告其平均内毒素活性。重复之间的强烈偏差，即低精度，表明其中至少有一个不能准确返回活性。通常情况下，BET精密度使用变异系数（CV，也称为相对标准差，RSD）进行量化，该系数是标准差除以平均值。事实上，CV可以根据BET中出现的几个单位进行计算，最常见的是原始或中间数据，例如开始时间。尽管如此，这种选择是基于这样的假设，即重复仅在信号输出方面有所不同，而在内毒素活性方面没有差异。或者，CV可以在内毒素浓度上计算，用来另外表示这种活性差异，例如，由于不可避免的移液误差。

有趣的是（图2），25%的CV（EU/mL）实际上可能比10%的CV（起始时间）更精确。同样，许多其他因素也会影响BET中的CV，如测量误差、移液延迟、温度、样品和试剂的异质性以及气泡和颗粒的存在。因此，材料、方法和人员的同质性是关键。

定性常涉及标准曲线的排他性生成。除了|r|，试剂制造商还对标准曲线参数（如线性曲线的斜率和y截距）或其他特定于不同回归模型的参数施加限制。无效斜率可能表明（系统性）移液错误、污染或内毒素吸附。除了后两者之外，试剂劣化或不合适的仪器设置也可能导致无效的y截距（渐近线在4PL）。

结论

本研究建立的BET标准有助于准确定量内毒素。了解基础数据的生成、数学基础和影响因素，可以优化方法并可靠地满足这些标准。这样，患者的安全仍有保障。